Sådan analyserer du elektroforese

I gelelektroforese separeres prøver af DNA eller proteiner - typisk baseret på størrelse - ved at anvende et elektrisk felt, der får dem til at migrere gennem en gel. Anvendelsen af ​​gelelektroforese er rutinemæssig i biomedicinske forskningslaboratorier og bruges til at besvare en række forskellige spørgsmål, så der er ikke rigtig en universel måde at analysere resultaterne på. Forskellige teknikker som Western blotting, Northern blotting og Southern blotting involverer for eksempel alle gelelektroforese. Hvis du laver agarose gelelektroforese af DNA-prøver, den mest almindelige form for procedure, skal du typisk gøre mindst to ting: 1) skelne ukendte plasmider fra indsatser, nickede plasmider og skære plasmider og 2) estimere størrelsen af de forskellige DNA-fragmenter. Sådan fungerer det.

Kontroller dit laboratoriebogsbog for at bestemme, hvilke prøver der blev indlæst i hvilke baner. Når du har lagt brøndene til din gel, skal du have noteret identiteten af ​​hver bane /prøve.

Bestem hvilken bane der indeholder "stigen" af DNA-standarder. Disse er fragmenter af kendt længde; deres migrationsafstand kan bruges til at bestemme størrelsen på prøvefragmenterne.

Brug en linjal måle afstanden på dit billede fra brøndene til sporingsfarvestoffet, som vil have rejst længere end nogen af ​​DNA-båndene (med andre ord vil det være i bunden af ​​gelen). Optag dette nummer - de enheder, du bruger, er ikke vigtige.

Mål afstanden på dit billede fra brøndene til hvert af båndene i "stigen", divider derefter den afstand med den afstand, der er rejst af sporing farvebånd. Denne beregning giver dig den relative mobilitet for hvert bånd.

Eksempel: Antag, at sporingsfarvebåndet rejste 6 tommer, og vi har tre bands, der rejste 5, 4,5 og 3,5 tommer. Hvad er deres relative mobilitet? Svar: Vi deler 5, 4,5 og 3,5 med 6 for at opnå relative mobiliteter på 0,833, 0,75 og 0,5833.

Indtast de relative mobiliteter i dit regnearksprogram (Excel eller et andet lignende program, du bruger) sammen med størrelse i kilobaser af hvert fragment i stigen. (Fabrikanten giver dig størrelsen af ​​hvert fragment i de stiger, de leverer, så du skal allerede have disse oplysninger.)

Graf dataene med relativ mobilitet på x og størrelse i kilobaser på y.

Brug Trendline-funktionen på dit regnearksprogram til at passe en ligning til dataene. Denne ligning bør være en magtligning (fx x ^ -2) og skal passe dataene relativt godt (R-koefficient på mindst 0,9).

Se på de bånd, der svarer til dine prøver. Husk at mindre DNA-fragmenter rejser længere igennem gelen end store DNA-fragmenter, så dem, der er tættest på sporingsfarvestoffet, vil være de mindste. Bemærk dog, at hvis plasmid (cirkulært) DNA er ubeskåret, bliver det "supercoiled" eller snoet som en telefonledning, hvilket faktisk vil medføre, at det rejser mere end lineært DNA af samme størrelse. Ligeledes vil et "nicked" plasmid, der er blevet ufuldstændigt skåret, rejse en SHORTER-afstand end lineært DNA af samme størrelse. Derfor kan du ikke estimere størrelsen af ​​ukendte plasmider fra din gel.

Match båndene i hver bane med identiteten af ​​den prøve, du har lagt i den bane, og afgøre, om hvad du ser, er hvad du ville have forventet . Dette vil afhænge af arten af ​​dit eksperiment. I almindelighed, hvis du fordøjede et insertplasmid med to restriktionsenzymer, ville du dog forvente, at indsætningen ville blive frigjort fra plasmidet; da det er meget mindre end plasmidet, ville du forvente at se to bånd i den bane, en nær toppen og den anden ned nær bunden. Et plasmidsnit med kun ét restriktionsenzym bør kun danne et enkelt bånd, der bevæger sig lidt længere end plasmidsnittet med to restriktionsenzymer, men ingen steder nær så langt som indsatsen.

Mål afstanden fra brøndene til klippe plasmidet og indsæt bånd med din lineal. Opdel disse tal med den afstand, der er sporet af sporingsfarvestoffet for at finde relativ mobilitet af skær og skær plasmider.

Slut den relative mobilitet af indsatser og skær plasmider i ligningen dit regnearksprogram beregnet for dig. Denne beregning skal give dig et skøn over størrelsen af ​​disse plasmider.

Tip

Hvis du ser lyse, brede bånd i bunden af ​​hver enkelt bane, har du sikkert nogle RNA i din gel - Din renseprotokol kan være fejlfri.