Ulemperne ved Western Blotting

Western blotting er en af ​​de mest almindelige procedurer i biokemiske laboratorier. I grund og grund adskiller det proteiner fra en prøve efter størrelse og testes derefter ved hjælp af antistoffer for at bestemme, om et givet protein er til stede. Det er nyttigt ikke kun i forskning, men også i medicinske eller diagnostiske laboratorier; test for både HIV og Lyme sygdom involverer for eksempel en enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) test efterfulgt af en Western blot, hvis ELISA testes positivt. På trods af sin popularitet har Western blotting flere ulemper.

Ikke-kvantitative

Klassiske vestlige blots er ikke-kvantitative. Med andre ord, mens de kan fortælle forskerne om et bestemt protein er til stede, gør de ikke det muligt at kvantificere, hvor meget protein der er til stede. Nogle biotekvirksomheder sælger nu kits, der gør det muligt for forskere eller laboratorieteknikere at kvantificere mængden af ​​protein til stede ved hjælp af en standardkurve - men det virker kun, hvis rene prøver af samme protein er tilgængelige. Desuden kan molekylvægten af ​​et protein kun estimeres med Western blotting, snarere end bestemt præcist som med massespektrometri.

Antistoffer

En Western blot kan kun udføres, hvis primære antistoffer mod Protein af interesse er tilgængelige. Mens antistoffer til mange forskellige proteiner er tilgængelige fra biotekvirksomheder, er de ikke billige; Hvis primære antistoffer ikke er tilgængelige for et givet protein, vil det ikke være muligt at udføre et Western blot, der søger det pågældende protein. Desuden kan forskere måske bestemme, om et protein er blevet modificeret på en eller anden måde - hvis det er phosphoryleret (havde en phosphatgruppe knyttet til det) - og med Western blot-teknikken har de brug for antistoffer, der er specifikke for den modificerede protein.

Træning

Det kan være udfordrende at udføre en Western blot korrekt og få gode resultater, så personalet skal være veluddannet. I dette som i meget andet er erfaring måske den bedste vejleder; selv for en erfaren tekniker er en western blot tidskrævende. Gelelektroforese-delen af ​​eksperimentet vil typisk tage fra en til to timer for at køre. Andre opgaver kan udføres, mens gelen kører, selvfølgelig, men eksperimentet tager stadig lang tid at få resultater.

Andre begrænsninger

Antistoffer kan nogle gange udvise nogle off-target bindinger, hvilket kan medføre dårligere resultater. Desuden bruger du med et Western blotting et antistof mod et specifikt protein, så dine resultater vil kun fortælle dig, om proteinet var til stede. Massespektrometri med høj opløsning afslører derimod alle proteiner, der er til stede i en prøve, og i modsætning til klassisk western blotting er det kvantitativt. Det er vigtigt at huske, at massespektrometri er meget dyrere og også mere teknisk udfordrende at bruge i forhold til Western blotting.