In-situ måling af 3-D proteinstruktur inde i levende eukaryote celler

Forskere fra Tokyo Metropolitan University har med succes bestemt den høje opløsning, tredimensionel struktur af proteiner inde i levende eukaryote celler. De kombinerede "in-cell" kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, et bioreaktorsystem og banebrydende beregningsalgoritmer til at bestemme proteinstrukturer i overfyldte intracellulære miljøer for første gang. Teknikken lover indsigt i den intracellulære adfærd af sygdomsfremkaldende proteiner og nye lægemiddelscreeningsapplikationer, tillader in-situ visualisering af, hvordan proteiner reagerer på biokemiske stimuli.

Eukaryote celler er byggestenene i en lang række organismer, inklusive alle svampe, planter og dyr. Deres indre struktur er ekstremt kompleks og varieret, med et indviklet strukturelt hierarki og en bred vifte af biomakromolekyler fordelt rundt om et cytoskeletnetværk. Dette har gjort det svært at se, hvad hvert protein inde i cellerne gør i dets naturlige miljø, på trods af de åbenlyse biomedicinske fordele ved at vide, f.eks. hvordan et bestemt protein reagerer, når celler udsættes for kemiske stimuli, ligesom farmaceutiske lægemidler.

For at tackle denne udfordring, et hold fra Tokyo Metropolitan University ledet af adjunkt Teppei Ikeya og professor Yutaka Ito anvendte nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopimålinger på specifikke proteiner udtrykt indeni sf9 dyrkede insektceller, en cellestamme, der oprindeligt stammer fra en type møllarve, der er meget brugt til proteinproduktion. Holdets banebrydende NMR-arbejde havde allerede haft held med at belyse højopløselige proteinstrukturer inde i bakterier (ikke-eukaryoter). Problemet med blot at anvende de samme teknikker til proteiner i sf9 celler var den signifikant lavere koncentration af målproteiner og korte levetid for celler, gør det vanskeligt at indsamle højkvalitets multidimensionelle NMR-spektre til nuklear Overhauser-effektspektroskopi (NOESY), som ville give præcis information om, hvordan forskellige atomer er fordelt inde i individuelle molekyler. Dermed, de kombinerede et sparsomt prøvetagningsbaseret hurtigt NMR-måleskema med avancerede beregningsmetoder, der anvender statistiske teknikker som Bayesiansk inferens, metoder skræddersyet til at belyse proteinstrukturer effektivt baseret på en begrænset mængde strukturel information fra in-celle NMR-spektre med iboende lav følsomhed. Et bioreaktorsystem var også udstyret inde i NMR-apparatet, som holdt cellerne i en sund tilstand under målingerne.

Med disse nye data, holdet var i stand til at belyse 3-D-strukturen af ​​tre modelproteiner med hidtil uset høj opløsning, med en præcision på 0,5 Ångstrom (0,05 nanometer) for positionen af ​​proteinets hovedkædeatomer. I særdeleshed, de identificerede en signifikant anderledes konformation i en lokaliseret region af et af proteinerne sammenlignet med dets referencestruktur i fortyndet opløsning. Konformationsforskellen mellem proteiner "i celler" og "i reagensglas" var formodentlig forårsaget af ikke-specifikke interaktioner med andre molekyler inde i cellerne. Det er ved at blive klart, at disse interaktioner bidrager til proteinernes biologiske funktioner:evnen til at lokalisere og kvantificere strukturelle ændringer af proteiner i et intracellulært miljø forventes at have en væsentlig indflydelse på biomedicinsk forskning, gør det muligt at se, hvordan forskellige forhold f.eks. neurodegenerative sygdomme påvirker proteinkonformationer in situ, og kvantitativt måle, hvordan behandlinger påvirker strukturelle anomalier.