Sådan tolk Agarose Gel

Når du har kørt DNA-prøver på en agarosegel og taget et billede, kan du gemme billedet til senere, hvorefter du kan analysere resultaterne og fortolke dem. De slags ting, du leder efter, vil afhænge af arten af ​​dit eksperiment. Hvis du laver DNA-fingeraftryk, vil du f.eks. Sammenligne størrelsen af ​​DNA-stykker fra to prøver - fra den mistænkte og fra en forbrydelsesscene, måske. Hvis du arbejder med plasmider fra bakterier, kan du muligvis sørge for, at plasmidet indeholder indsatsen. Derfor kan du fortolke din gel afhængigt af det eksperiment, du gjorde. Ikke desto mindre er der nogle generelle regler, du kan anvende.

Start fra toppen af ​​billedet, måle afstanden til hvert bånd i "gelens standard" -bane (også stigen). Standardbanen indeholder DNA-stykker, hvis størrelse allerede er kendt, så du bør allerede vide størrelsen på hver, før du starter dit eksperiment. Måler også den afstand, som båndene rejste i hver af prøvebanerne.

Del afstanden hver standard og hvert bånd i de prøver, der er rejst af afstanden til bunden af ​​gelen. Resultatet kaldes den relative mobilitet. Du kan bruge regnearksprogrammet til at gøre regningen for dig, hvis det gør dette trin hurtigere.

Indtast den relative mobilitet og størrelse for hver standard i dit regnearkprogram, og brug derefter dit regnearksprograms grafværktøj til at oprette en graf af disse data med relativ mobilitet på x-aksen og størrelsen på y.

Tilpas en linje til grafen ved hjælp af ikke-lineær regression. Kontakt dit regnearksprograms Help-afsnit, hvis du har brug for at vide, hvordan du gør dette. Du skal ende med en ligning, måske en, der ligner følgende:

y = (0.3) x ^ -2.5

Bemærk, at x her vil være den relative mobilitet, mens y er den størrelse. Bemærk også, at din ligning kan have helt forskellige tal for eksponenten og koefficienten - denne ligning er kun givet som et hypotetisk eksempel.

Tag den relative mobilitet for båndene fra din prøve og sæt den ind som x at beregne størrelsen af ​​DNA-stykkerne i prøvebåndene.

Antag, at ligningen afledt af dit regnearkprogram faktisk var y = (0,3) x ^ -2,5, og den relative mobilitet for et bestemt prøvebånd var 0,68 . Ved at erstatte 0,68 i din ligning finder du følgende:

y = (0.3) (0.68) ^ - 2.5

Ved hjælp af din lommeregner hæver du 0,68 til -2,5 og finder følgende:

y = (0.3) (2.62)

y = 0.786

som ville da være den estimerede størrelse i kilobaser af DNA'et i et af båndene fra din prøve.

Plasmider

Bemærk, at du måske eller måske ikke behøver at bruge instruktionerne i dette afsnit. Agarosegelelektroforese anvendes ofte til at bekræfte, at et plasmid indeholder en given insert. Hvis du ikke arbejder med plasmider, kan du springe over dette afsnit. Hvis du er, kan du dog følge disse instruktioner.

Bemærk, at hvis du arbejder med ukendte eller nickede plasmider, kan du ikke estimere størrelsen ved hjælp af proceduren fra afsnit 1 ovenfor. Det skyldes, at ukendte og nickede plasmider migrerer med forskellige hastigheder fra lineært DNA.

Sammenlign antallet af bånd i hver bane. Husk at et restriktionsenzym skærer DNA på steder, hvor en given sekvens kaldes restriktionsstedet forekommer. Hvis en prøve blev behandlet med to restriktionsenzymer, skal et bånd til indsatsen og et bånd for resten af ​​plasmidet begge være til stede. Det skyldes, at indsatsen vil blive flankeret af to restriktionssteder, hver for et andet enzym, så udskæringer på begge disse steder vil frigøre indsatsen fra plasmidet. Et snit på kun et sted vil derimod konvertere plasmidet til lineært DNA. En prøveafskæring uden restriktionsenzymer eller et restriktionsenzym skulle da have et enkelt bånd, mens en prøveafskæring med to restriktionsenzymer skulle have to bånd.

Hold øje med bånd, der er skabt af nicked plasmid DNA. Et nicked plasmid har kun en snit i en enkelt streng, så den migrerer langsommere end et skåret plasmid. Klipp plasmiderne igen, migrere langsommere end uhindret DNA.

Estimér størrelsen af ​​indsatsen ved hjælp af proceduren beskrevet i afsnit 1 og afgøre, om den svarer til dine forventninger (som varierer afhængigt af eksperimentet.)