Hvordan en stikprøve af DNA indsamles og forberedt til Study

Før de kan sekvensere DNA eller ændre det gennem genteknologi, skal forskerne først isolere det. Dette kan virke som en vanskelig opgave, da celler indeholder en lang række andre forbindelser som proteiner, fedtstoffer, sukkerarter og små molekyler. Heldigvis kan biologer benytte DNA's kemiske egenskaber til at adskille DNA fra disse forurenende stoffer og forberede det til yderligere undersøgelse. Denne proces kaldes DNA-ekstraktion.

Cell Lysis

Der er mange forskellige teknikker anvendt til DNA-ekstraktion. Den, der bruges af et enkelt laboratorium, afhænger af typen af ​​forsøg, der skal udføres, og hvor rent DNA skal være. Forskere starter generelt med en prøve, der indeholder celler - eksempelvis et væv eller en blodprøve - og bryder cellerne åbne eller lyser dem. Der er mange forskellige måder, hvorpå du kan lysere celler. Tilføjelse af et vaskemiddel vil få dem til at komme fra hinanden, som vil underkaste dem højfrekvente lydbølger. Alternativt kan prøven blandes med glasperler og vibrere hurtigt, fysisk bryde cellerne adskilt og frigive deres indhold.

Hurtige og beskidte metoder

Hvis høj renhed ikke er påkrævet, kan forskere tilføje en enzym kaldet proteinase K for at nedbryde de fleste proteiner i prøven, så brug det som det er. Denne teknik er imidlertid meget beskidt, da de fleste forureninger stadig er til stede, så det er kun egnet, hvis hastigheden er en prioritet, og renhed er ikke noget problem. En anden hurtig og beskidt tilgang er at fjerne proteiner ved at øge saltkoncentrationen ved at tilsætte salte som ammonium eller kaliumacetat for at tvinge proteinerne til at udfælde. Denne teknik er også ret beskidt, da mange andre forurenende stoffer stadig er til stede.

Phenol-Chloroform Extraction

En anden tilgang er at lysere cellerne med rengøringsmiddel, og bland derefter opløsningen med isoamylalkohol, chloroform og phenol . Opløsningen adskilles derefter i to lag. Proteiner ender i det øvre organiske lag, mens DNA forbliver i det nedre vandige lag. Denne teknik kræver omhyggelig kontrol af saltkoncentration og pH for gode resultater. Det er tidskrævende, og både phenol og chloroform er stærkt giftige kemikalier. Følgelig er phenol-chloroform ekstraktioner en gang rutinemæssig blevet andre teknikker blevet mere populære i de seneste år.

Anionbytningskromatografi

Anionbytningskromatografi giver højere renhed og mere konsistente resultater end phenol -kloroformekstraktion. Et rør eller en søjle er pakket med små partikler, der har positivt ladede steder på dem, hvor et negativt ladet molekyle eller anion kan binde. DNA binder til disse anionbyttersteder, medens andre forurenende stoffer som proteiner og RNA vaskes ud af søjlen. Senere bruges en saltrig opløsning til at trække DNA'et ud af søjlen.

Kits

Den hurtigste og mest pålidelige teknik til rensning af DNA er brugen af ​​et specialfremstillet kit. Disse kits indeholder silicagelmembraner i et rør. DNA stikker til membranen, mens andre forureninger vaskes væk ved hjælp af en række specialfremstillede saltløsninger, der følger med sættet. Endelig vaskes DNA'et ud af søjlen med en lav-saltopløsning. Disse kits er hurtige, nemme at bruge og giver reproducerbare resultater.

Absorbans

Når DNA'et er blevet isoleret og resuspenderet i en pH-styret bufferopløsning, er det sidste trin at teste dets renhed . En nem og bekvem måde at gøre det på er ved at tjekke, hvor meget ultraviolet lys det absorberer ved 260 og 280 nanometerbølgelængder. Absorptionen ved 260 nanometer divideret med absorption ved 280 nanometer bør ligge 1,8 hvis DNA'et er rent. Måling af absorbans ved 260 nanometer giver dig også mulighed for at bestemme koncentrationen af ​​DNA'et.