Hvad er funktionen af en Tris-puffer i DNA-ekstraktion?

Tris eller tris (hydroxymethyl) aminomethan, er en almindelig biologisk puffer, der bruges i hele DNA-ekstraktionsprocessen. Under ekstraktion fra et vilkårligt antal kilder er DNA pH-følsomt. Under cellelysering, fjernelse af uønskede cellulære komponenter og præcipitation anvendes tris til at opretholde en stabil pH. Derudover spiller det en særlig vigtig rolle i cellelysering.

TL; DR (for lang; læste ikke)

DNA-ekstraktion er en pH-følsom proces og ved hjælp af en trisbuffer hjælper med at holde pH-værdien stabil over cellelysering og ekstraktion.
Tris som en buffer

Da pH kan påvirke og blive påvirket af et antal cellulære faktorer, er opretholdelse af en stabil pH afgørende for eksperimentel videnskab. Biologiske buffere, ligesom tris, er vigtige, fordi de kan opretholde en stabil pH trods påvirkninger, der ellers kan ændre pH. Tris (hydroxymethyl) aminomethan, med en pKa på 8,1, er en effektiv puffer mellem pH 7 og 9. På grund af sit neutrale interval er tris en almindeligt anvendt puffer i biologiske laboratorier. Tris-buffer er imidlertid temperaturfølsom og bør bruges ved den temperatur, hvorpå den oprindeligt blev pH-værdi for at undgå unøjagtighed.
Lysis af celler -

Lysis, eller hvis cellerne brydes, er det første trin af DNA udvinding. Dette opnås med en buffer indeholdende tris og EDTA (ethylendiaminetetraeddikesyre). EDTA binder divalente kationer, såsom calcium og magnesium. Da disse ioner hjælper med at bevare cellemembranens integritet, destabiliserer membranen dem ved at fjerne dem med EDTA. Tris er den vigtigste bufferkomponent; dens vigtigste rolle er at opretholde pH-værdien af pufferen på et stabilt punkt, sædvanligvis 8,0. Derudover interagerer tris sandsynligvis med LPS (lipopolysaccharid) i membranen, hvilket tjener til at destabilisere membranen yderligere.
Tris Beskytter DNA fra pH-skift

Når cellerne brydes fra hinanden, spildes deres DNA og indhold ind i bufferen. Derudover er RNase A (ødelægger RNA), proteaser (ødelægger proteiner), og SDS (natriumdodecylsulfat, solubiliserer membranfragmenterne) er ofte inkluderet. Sammenlagt kan denne suppe med cellulært indhold og fragmenteret RNA og proteiner have en stor indflydelse på opløsningens pH. Fordi DNA er pH-følsomt, er det vigtigt for tris at buffe suppen og opretholde pH på et jævnt punkt.
DNA-præcipitering -

I det sidste trin af DNA-ekstraktion ekstraheres selve DNA'et fra løsning. På dette tidspunkt er DNA'et opløseligt i pufferen. For at ekstrahere fra opløsningen gøres DNA uopløseligt ved tilsætning af ethanol eller isopropanol (isopropylalkohol). Når dette er gjort, bliver DNA'et tydeligt i opløsning som et hvidt, klar stof. Selvom DNA kan isoleres fra de resterende cellulære komponenter på denne måde, er det ikke "anvendeligt", når det er uopløseligt. Efter isolering fjernes alkoholen, og DNA skal returneres til en biologisk buffer, ligesom tris, for at blive brugt.
Gør det selv -

Selvom ekstraktion af DNA ofte udføres i forskningslaboratorier, der normalt bruger et af et antal kommercielt tilgængelige sæt, kan enhver lave DNA-ekstraktion derhjemme ved hjælp af almindelige husholdningsartikler og grønne ærter eller spinat. I dette tilfælde er tris eller nogen biologisk puffer ikke til stede for at beskytte DNA'et mod pH-forskydninger. Det er dog en visuel måde at hjælpe studerende med at oprette forbindelse til cellulært DNA.