Under transkription læser RNA-polymerase, enzymet, der er ansvarlig for syntetisering af RNA, DNA-skabelonen i en 5'- til 3'-retning. Denne retningsbestemmelse er afgørende, fordi RNA-polymerase kun kan tilføje nukleotider til den voksende RNA-kæde i 5'- til 3'-retningen.
Ensrettet transkription sikrer, at RNA-transkripterne syntetiseres i den korrekte orientering, hvor 5'-enden svarer til starten af genet og 3'-enden svarer til genets ende. Afvigelser fra denne ensrettede proces, såsom bidirektionel transkription eller tilstedeværelsen af mellemliggende sekvenser, kan resultere i dannelsen af ikke-funktionelle eller trunkerede RNA-transkripter.
Ensrettet transkription har også implikationer for genregulering. Forskellige regulatoriske mekanismer, såsom promotorsekvenser, enhancere og terminatorer, fungerer på en sekvensspecifik måde til at kontrollere henholdsvis initiering, forlængelse og terminering af transkription. Disse regulatoriske elementer genkendes og anvendes af RNA-polymerase i den rigtige 5'- til 3'-retning, hvilket muliggør præcis kontrol af genekspression.