Hvad er indre membranprotein og ydre, hvordan kan du komme fra E. coli, hvordan man adskiller proteinet?

indre membranproteiner og ydre membranproteiner i E. coli

indre membranproteiner (IMPS) :Disse proteiner er indlejret i den indre membran af E. coli, en phospholipid -dobbeltlag, der omslutter cytoplasmaet. De spiller afgørende roller i forskellige cellulære funktioner, herunder:

* transport: Letter bevægelsen af ​​næringsstoffer, ioner og affaldsprodukter over membranen.

* signaltransduktion: Videresende signaler fra miljøet til cellens indre.

* Energimetabolisme: Deltagelse i processer som elektrontransport og ATP -syntese.

ydre membranproteiner (OMPS) :Disse proteiner er placeret i den ydre membran af E. coli, en anden phospholipid -dobbeltlag, der omgiver den indre membran og giver strukturel støtte og beskyttelse. De er involveret i:

* Porindannelse: Oprettelse af kanaler, der tillader passage af små molekyler.

* receptoraktivitet: Binding til specifikke molekyler og udløsende cellulære responser.

* Adhæsion: Fastgøres til overflader eller andre celler.

Adskillelse af indre og ydre membranproteiner fra E. coli

Her er en generel tilgang til at adskille disse proteintyper fra E. coli:

1. Cellelysering:

* Mekanisk lysis: Brug metoder som sonikering eller fransk presse til at forstyrre cellevæggen og frigive celleindholdet.

* Kemisk lysis: Brug vaskemidler som Triton X-100 eller SDS til at opløse membranlipiderne.

2. Differentialcentrifugering:

* lavhastighedscentrifugering (10.000 x g): Dette trin fjerner celleaffald, inklusive ubrudte celler og store cellulære komponenter.

* højhastighedscentrifugering (100.000 x g): Dette trin adskiller de indre og ydre membraner fra den opløselige cytoplasma. Pelleten, der indeholder begge membraner, indsamles.

3. Membranfraktionering:

* Sucrose Gradient Centrifugering: Denne metode adskiller membranerne baseret på deres densitet. Den ydre membran er typisk mindre tæt end den indre membran, hvilket muliggør deres adskillelse.

* Triton X-114-faseopdeling: Denne teknik bruger et ikke -ionisk vaskemiddel til at adskille proteinerne baseret på deres hydrofobicitet. IMPS er mere hydrofobe end OMP'er, hvilket fører til deres opdeling i det vaskemiddelrige fase.

4. Oprensning:

* Affinitetskromatografi: Denne teknik anvender specifikke ligander, der binder til målproteinet, hvilket muliggør dets adskillelse fra andre proteiner.

* ionudvekslingskromatografi: Denne metode adskiller proteiner baseret på deres ladning.

* STØRRELSEKROMATOGRAFI: Denne teknik adskiller proteiner baseret på deres størrelse.

5. Bekræftelse:

* SDS-PAGE: Denne elektroforese -teknik adskiller proteiner baseret på deres molekylvægt.

* Western blotting: Denne teknik bruger antistoffer til at detektere specifikke proteiner.

Vigtige noter:

* Den specifikke protokol afhænger af målproteinet og dets egenskaber.

* Optimering af hvert trin er afgørende for opnåelse af rent og funktionelt protein.

* Teknikker som massespektrometri kan bruges til yderligere analyse af de adskilte proteinfraktioner.

Kommercielle sæt:

Flere kommercielle sæt er tilgængelige til isolering af E. coli indre og ydre membranproteiner, som kan forenkle processen.

Ved at følge disse trin og vælge de passende teknikker kan forskere med succes adskille og rense indre og ydre membranproteiner fra E. coli, hvilket muliggør yderligere analyse af deres struktur, funktion og interaktioner.