Hvordan isolerer biologer cellekomponenter?

Biologer bruger en række teknikker til at isolere cellekomponenter, afhængigt af det specifikke organelle eller molekyle, de er interesseret i. Her er nogle af de mest almindelige metoder:

1. Celleforstyrrelse:

* Mekaniske metoder:

* homogenisering: Brug af en blender eller en højhastighedshomogenisator til fysisk at bryde åbne celler.

* Sonikering: Brug af lydbølger til at forstyrre cellemembraner.

* fransk presse: Tvinger celler gennem en lille åbning under højt tryk.

* slibning: Ved hjælp af en mørtel og en pestle til fysisk at bryde celler.

* Kemiske metoder:

* vaskemidler: Forstyrr cellemembraner ved opløsning af lipider.

* enzymer: Brug specifikke enzymer som lysozym til at nedbryde cellevægge.

* osmotisk chok: Ændring af det osmotiske tryk fra opløsningen for at forstyrre cellemembraner.

2. Differentialcentrifugering:

* Efter celleforstyrrelse spindes cellelysatet med stigende hastigheder og varigheder. Dette adskiller komponenter baseret på deres størrelse og densitet.

* lavhastighedscentrifugering: Pellet større komponenter som kerner og celleaffald.

* mellemhastighedscentrifugering: Pellet mitokondrier og lysosomer.

* Højhastighedscentrifugering: Pelletmikrosomer og ribosomer.

* ultracentrifugering: Pellet mindre komponenter som proteiner og nukleinsyrer.

3. Densitetsgradientcentrifugering:

* Denne metode forbedrer yderligere den adskillelse opnået ved differentiel centrifugering. En gradient af saccharose eller andre stoffer oprettes i et rør, og cellelysatet er lagdelt på toppen. Under centrifugering bevæger komponenter sig gennem gradienten, indtil de når en densitet lig med deres egen.

* Typer:

* Sucrose Gradient: Almindeligt brugt til at adskille organeller.

* cesiumchloridgradient: Fremragende til isolering af DNA og RNA.

4. Affinitetskromatografi:

* Denne metode udnytter den specifikke binding af et målmolekyle til en immobiliseret ligand på en søjle.

* ligand: Et molekyle, der binder specifikt til målmolekylet.

* kolonne: En fast matrix med den immobiliserede ligand.

* eluering: Efter binding elueres målmolekylet fra søjlen ved hjælp af en bestemt opløsning.

5. Elektroforese:

* Bruges til at adskille proteiner baseret på størrelse og ladning og nukleinsyrer baseret på størrelse.

* SDS-PAGE: Adskiller proteiner baseret på størrelse.

* Agarose gelelektroforese: Adskiller nukleinsyrer baseret på størrelse.

6. Immunudfældning:

* Denne metode bruger antistoffer til at isolere specifikke proteiner.

* Antistoffer: Bind til et specifikt protein af interesse.

* nedbør: Efter binding udfældes protein-antistofkomplekset ud af opløsningen.

7. Flowcytometri:

* Denne metode bruger lasere og fluorescerende sonder til at analysere og sortere celler eller cellekomponenter baseret på deres fysiske og biologiske egenskaber.

Eksempel:Isolering af mitokondrier

* Celler forstyrres ved hjælp af homogenisering eller en fransk presse.

* Cellelysatet er centrifugeret ved en medium hastighed til pellet mitokondrier.

* Pelleten er resuspenderet og oprenses yderligere ved hjælp af densitetsgradientcentrifugering.

Valget af metode afhænger af den specifikke celletype, organellen eller molekylet af interesse og det ønskede renhedsniveau. Hver teknik har sine styrker og svagheder, og forskere bruger ofte en kombination af metoder til at opnå deres ønskede resultater.