En videnskabsmand ønsker at kunne kunstigt fremstille et protein, der produceres i frøerne. Det har placeret alt mRNA ved lever og cDNA. Hvad skal du?

1. Isolere mRNA for målproteinet:

* RNA -ekstraktion: Videnskabsmanden bliver nødt til at opnå levervæv fra frøer og udtrække det samlede RNA. Dette involverer at forstyrre cellerne og bruge specialiserede reagenser til at adskille RNA fra andre cellulære komponenter.

2. Opret et cDNA -bibliotek:

* omvendt transkription: Ved hjælp af det isolerede mRNA udfører videnskabsmanden omvendt transkription. Dette er en proces, hvor et enzym kaldet omvendt transkriptase omdanner mRNA til komplementært DNA (cDNA). Dette cDNA vil fungere som skabelon til kloning.

* cDNA Library Construction: CDNA indsættes derefter i vektorer (normalt plasmider), der kan replikeres inden i bakterier. Denne samling af vektorer, der indeholder forskellige cDNA -fragmenter, kaldes et cDNA -bibliotek.

3. Screen biblioteket for målet cDNA:

* sonde design: Videnskabsmanden har brug for en sonde for at identificere cDNA, der koder for det ønskede frøprotein. Denne sonde kan være:

* oligonukleotidprobe: En kort, syntetisk DNA -sekvens designet baseret på den kendte sekvens af målproteinet (hvis tilgængeligt).

* antistofprobe: Et antistof, der er specifikt for målproteinet, kan bruges til at detektere det tilsvarende cDNA på biblioteket.

* screening: CDNA -biblioteket screenes med sonden. Dette kan gøres ved hjælp af teknikker som:

* kolonihybridisering: Bakterier, der indeholder cDNA -biblioteket, er udpladet på agar. Sonden er mærket og får lov til at binde til kolonierne. Kolonier, der indeholder målcDNA, vil hybridisere med sonden og kan identificeres.

* PCR -screening: PCR (polymerasekædereaktion) kan bruges til at amplificere målcDNA ved anvendelse af primere designet fra den kendte sekvens.

4. Sekvens og verificer målet cDNA:

* sanger -sekventering: Når målet cDNA er isoleret, skal det sekventeres for at bekræfte dets identitet og sikre, at det koder for det korrekte protein.

* Bioinformatikanalyse: CDNA -sekvensen kan sammenlignes med databaser for at finde homologe sekvenser og bekræfte dens identitet.

5. Design og konstruer en ekspressionsvektor:

* Ekspressionsvektor: Forskeren har brug for en vektor, der kan bruges til at udtrykke målproteinet i en passende værtsorganisme (f.eks. Bakterier, gær eller pattedyrceller). Denne ekspressionsvektor vil omfatte:

* promotor: En DNA -sekvens, der driver ekspressionen af målgenet.

* målgen (cDNA): Det isolerede cDNA, der koder for frøproteinet.

* ribosombindingssted (RBS): En sekvens, der hjælper ribosomer med at initiere proteinsyntese.

* Udvælgelsesmarkør: Et gen, der muliggør valg af celler, der har optaget ekspressionsvektoren.

6. Transform ekspressionsvektoren til en værtsorganisme:

* Transformation: Ekspressionsvektoren, der indeholder målcDNA, indføres i en værtsorganisme (f.eks. Bakterieceller).

* valg: De transformerede celler vælges ved hjælp af selektionsmarkøren i ekspressionsvektoren.

7. Express og rens målproteinet:

* Proteinekspression: Værtcellerne dyrkes under betingelser, der fremmer ekspression af målproteinet.

* Proteinoprensning: Proteinet ekstraheres fra cellerne og oprenses ved anvendelse af teknikker som kromatografi for at adskille det fra andre cellulære komponenter.

8. Karakterisering og analyse:

* verifikation: Det oprensede protein analyseres for at bekræfte dets identitet, foldning og aktivitet.

* Funktionelle undersøgelser: Proteinet kan bruges til yderligere forskning, såsom at undersøge dets funktion, interaktion med andre molekyler eller dets potentielle terapeutiske anvendelser.

Vigtige overvejelser:

* Proteinfoldning: Det er vigtigt at sikre, at proteinfoldningen er korrekt i værtsorganismen.

* post-translationelle ændringer: Nogle proteiner kræver modifikationer (f.eks. Glycosylering) efter oversættelse. Værtsorganismen er muligvis ikke i stand til at udføre disse modifikationer, hvilket kan påvirke proteinets funktion.

* etik og sikkerhed: Korrekte etiske overvejelser og sikkerhedsprotokoller skal følges, når man arbejder med frøvæv og genetisk modificerede organismer.

Fortæl mig, hvis du gerne vil have flere detaljer om et specifikt trin!