Logisk arbejdsgang til inkorporering af fremmed DNA i organismer

Thinkstock Images/Comstock/Getty Images

I de tidlige dage af genteknologi virkede ideen om at pode egenskaber fra en organisme til en anden langt ude. I dag er indsættelse af fremmed DNA i et værtsgenom imidlertid en rutineproces, uanset om det er at tilføje skadedyrsresistente gener til majs, udtrykke human insulin i bakterier eller modellere humane kræftformer i mus. Selvom de tekniske detaljer kan være indviklede, forbliver den overordnede rækkefølge af trin konsekvent og logisk.

Trin 1

Begynd med at behandle plasmid-DNA'et og det fremmede DNA-fragment med et valgt restriktionsenzym. Disse enzymer genkender specifikke basismotiver og laver præcise snit, hvilket genererer kompatible ender til nedstrøms ligering. Restriktionsenzymer er naturligt afledt af bakterielle forsvarssystemer, der spalter invaderende viralt DNA.

Trin 2

Bland derefter det fordøjede plasmidrygrad med det spaltede fremmede DNA og tilsæt DNA-ligase. De resulterende komplementære klæbrige ender annealer, og ligase forsegler hakkene og producerer cirkulære plasmider, der bærer det indsatte DNA-segment.

Trin 3

Indfør de rekombinante plasmider i kompetente bakterieceller og lad dem komme sig. De kolonier, der har optaget plasmidet, vil vokse på selektive medier, der indeholder det passende antibiotikum, takket være resistensmarkøren kodet på plasmidet. Transformation kan opnås via varmechok, elektroporation eller kemisk kompetence, afhængigt af bakteriestammen.

Trin 4

Høst celler fra individuelle kolonier, lysér dem med en detergentbuffer for at frigive plasmid-DNA, og denaturerer derefter strengene ved varme- eller alkalibehandling. Dette forbereder DNA'et til nedstrøms screening.

Trin 5

Hybridiser det ekstraherede DNA med en fluorescensmærket probe, der er komplementær til den indsatte sekvens. Udsæt prøven for UV-belysning; regioner med perfekt match vil udsende fluorescens, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af det fremmede gen.

Trin 6

Vælg kolonier, der testede positive for insertet, udvid dem, og isoler plasmid-DNA'et. Amplificer om nødvendigt plasmidet ved PCR for at generere tilstrækkeligt materiale til yderligere analyser eller downstream-applikationer.

Ting påkrævet

• restriktionsenzymer
• plasmid-DNA
• fremmed DNA-fragment (genomisk DNA)
• DNA-ligase
• cellekulturmedium
• fluorescerende probe DNA-fragment
• polymerasekædereaktionsmaskine
• natriumhydroxid
• vækstmedium