Hvordan videnskabsmænd isolerer DNA:Fra cellelyse til renhedsvurdering

Comstock/Comstock/Getty Images

Før DNA kan sekventeres eller redigeres, skal forskerne først isolere det fra den cellulære matrix. Selvom celler indeholder en blanding af proteiner, lipider, kulhydrater og små molekyler, gør DNA's unikke kemiske egenskaber det muligt at separere og rense det til nedstrømsanalyse.

Cellelyse

Det indledende trin i enhver DNA-ekstraktionsarbejdsgang er cellelyse. Afhængigt af prøvetypen og den påkrævede renhed vælger laboratorierne mellem mekaniske, enzymatiske eller detergentbaserede metoder. Detergenter opløseliggør cellulære membraner, højfrekvente ultralydsbølger (sonikering) forstyrrer membraner gennem kavitation, og perleslag – hvor glasperler vibrerer mod prøven – giver en hurtig, fysisk afbrydelse, der frigiver nukleinsyrer.

Hurtige og beskidte tilgange

Når hastighed opvejer renhed, anvender videnskabsmænd nogle gange en minimal oprydning. Tilsætning af proteinaseK nedbryder størstedelen af ​​proteiner, hvilket gør det muligt at bruge prøven med kun mild oprensning. Alternativt udfælder høje saltkoncentrationer (f.eks. ammonium- eller kaliumacetat) proteiner, men mange andre kontaminanter forbliver. Disse metoder er velegnede til hurtig screening, men er uegnede til anvendelser, der kræver DNA af høj kvalitet.

Phenol-chloroform-ekstraktion

Phenol-chloroform-ekstraktion forbliver en klassisk teknik, selvom den nu er mindre almindelig på grund af toksicitet og arbejdsintensitet. Celler lyseres med detergent og blandes derefter med en blanding af phenol:chloroform:isoamylalkohol. Ved centrifugering adskilles opløsningen i en vandig fase (nederst), der bevarer DNA, og en organisk fase (øverst), der fanger proteiner og lipider. Omhyggelig kontrol af saltkoncentration og pH er afgørende for optimal genopretning. Fordi phenol og chloroform er farlige, er mange laboratorier flyttet til sikrere alternativer.

Anionbytningskromatografi

Anionbytterkromatografi giver højere renhed og reproducerbarhed. Søjlematrixen indeholder positivt ladede grupper, der binder negativt ladet DNA. Proteiner, RNA og andre kontaminanter vaskes væk, og DNA elueres efterfølgende med en buffer med højt saltindhold. Denne metode er især værdifuld til præparativ oprensning.

Kommercielle sæt

Silica-baserede spin-søjlesæt er blevet guldstandarden for hurtig, reproducerbar DNA-oprensning. DNA binder sig til en silicamembran i nærvær af kaotropiske salte, mens forurenende stoffer vaskes væk. Efter en sidste skylning med lavt saltindhold elueres DNA i en lille mængde TE eller vand, hvilket giver materiale af høj kvalitet på få minutter.

Vurdering af renhed ved absorption

Efter isolering placeres DNA-opløsningen typisk i en pH-kontrolleret buffer. Dens renhed verificeres ved at måle ultraviolet absorbans ved 260nm og 280nm. Et forhold på 260/280 på ~1,8 indikerer høj renhed, mens lavere forhold tyder på proteinforurening. Absorbans ved 260 nm giver også et ligetil estimat af DNA-koncentration.