Nøjagtig mikrobiel kvantificering:En guide til kolonitælling i mikrobiologi

Thinkstock/Stockbyte/Getty Images

Bestemmelse af koncentrationen af mikrober i en prøve er afgørende for kvalitetskontrol i laboratorier, fødevaresikkerhed og miljøovervågning. En gennemprøvet metode er at udføre serielle fortyndinger, udplade prøven på agar, inkubere og tælle de resulterende kolonier. Hver koloni opstår fra en kolonidannende enhed (CFU) - en enkelt celle eller en klynge, der kan replikere på vækstmediet. Ved at tælle kolonier på plader, der indeholder mellem 30 og 300 kolonier, kan forskere beregne den mikrobielle belastning med sikkerhed.

Fortynding, plettering og inkubation

Blot at sprede en rå prøve på en agarplade vil producere en sammenflydende græsplæne af kolonier, hvilket gør individuelle kolonier umulige at skelne. For at undgå dette skal du først suspendere prøven i et flydende medium og derefter udføre en serie på 6-10 serielle fortyndinger. Typisk udplades 0,1 ml af hver fortynding på en frisk agaroverflade, fordeles jævnt og inkuberes ved den passende temperatur i 4-7 dage. Inkubationsperioden tillader hver CFU at vokse til en synlig, tællig koloni.

Manuel kolonitælling

Manuel optælling kræver omhyggelig teknik. Placer petriskålen på et gennemsigtigt gitter eller overlay, og tæl kolonier i hver celle sekventielt. Ved at markere bagsiden af ​​fadet eller bruge et optællingssystem forhindrer du dobbelttælling. For robust statistik, tæl mindst tre plader pr. fortynding og kasser plader, der falder uden for 30-300 koloniområdet; sådanne plader indikerer over- eller underfortynding og skal genudplades.

Automatisk kolonioptælling

For at reducere menneskelige fejl og øge gennemløbet optager automatiserede kolonitællere et billede i høj opløsning af pladen, segmenterer kolonierne fra baggrunden og anvender billedanalysealgoritmer til at opgøre kolonierne. Selvom denne teknologi forbedrer hastigheden og konsistensen, kan den kæmpe med at adskille kolonier, der rører ved kanterne, en begrænsning, der fortsætter med at drive softwareforbedringer.

Begrænsninger af kolonitælling

Kolonidannende enheder kan bestå af enkeltceller, kæder eller klumper; således kan antagelsen om, at én koloni er lig med én celle, undervurdere sand mikrobiel tæthed. Derudover vil kun organismer, der trives under de valgte medier og inkubationsbetingelser, danne kolonier, så metoden kan gå glip af levedygtige, men ikke-dyrkbare celler. Endelig tager kolonitællinger ikke højde for døde celler i den originale prøve.