Mastering Gel Elektroforese Analyse:En praktisk vejledning

Af John Brennan
Opdateret 24. marts 2022

Gelelektroforese forbliver arbejdshesten i molekylærbiologiske laboratorier. Ved at anvende et elektrisk felt adskilles DNA og proteiner - sædvanligvis efter størrelse - inden for en gelmatrix. Selvom teknikken er almindelig, varierer den måde, resultaterne fortolkes på, med nedstrømsapplikationen, uanset om det er en Western blot, Northern blot, Southern blot eller simpel agarosekørsel.

Når du arbejder med agarosegeler, dominerer to opgaver:1) at skelne uudskårne, afskårne og lineære plasmider fra din indsats og 2) estimere fragmentstørrelser ved hjælp af en pålidelig standardkurve. De følgende trin leder dig gennem denne proces på en klar, reproducerbar måde.

Trin 1 – Identificer dine baner

Se din laboratorie-notesbog for at bekræfte, hvilken prøve der blev indlæst i hver bane. Banemærkaterne, du registrerede på tidspunktet for indlæsningen, er dit udgangspunkt for alle efterfølgende beregninger.

Trin 2 – Find DNA-stigen

Stigen indeholder fragmenter af kendt længde. Dens migrationsafstande vil tjene som reference for størrelsen af dine ukendte bånd.

Trin 3 – Mål sporingsfarven

Brug en lineal til at måle afstanden fra brønden til sporingsfarven (det farvestof, der rejser længst). Optag denne værdi; enhederne er vilkårlige, så længe de er konsistente.

Trin 4 – Bestem relativ mobilitet

Mål hvert stigebånds afstand fra brønden, og divider derefter med sporingsfarveafstanden. Dette giver den relative mobilitet (mobilitetsfaktor) for hver standard.

Eksempel:Hvis sporingsfarvestoffet bevægede sig 6 tommer, og stigebåndene bevægede sig 5, 4,5 og 3,5 tommer, er de relative mobiliteter 0,833, 0,75 og 0,583.

Trin 5 – Registrer mobilitet og størrelse

Indtast de relative mobiliteter og tilsvarende fragmentstørrelser (i kilobaser) i et regneark. Producenter angiver typisk disse størrelser i stigens datablad.

Trin 6 – Plot dataene

Opret en graf med relativ mobilitet på X-aksen og fragmentstørrelse på Y-aksen.

Trin 7 – Tilpas en standardkurve

Brug Trendline-funktionen til at tilpasse en magtlovsligning (f.eks. y =ax^‑2). Sigt efter en R² på mindst 0,90 for at sikre en pålidelig kurve.

Trin 8 – Inspicer prøvebånd

Mindre fragmenter migrerer længere. Bemærk, at supercoiled (uskårne) plasmider rejser længere end lineære fragmenter af samme størrelse, mens hakkede plasmider migrerer langsommere.

Trin 9 – Match bånd til prøver

Krydsreferencer hver banes bånd med den prøve, du har indlæst. For et plasmid, der er fordøjet med to enzymer, bør du se to forskellige bånd:et nær toppen (indsæt) og et nær bunden (skåret plasmid). En enkelt-enzymfordøjelse bør producere et enkelt bånd, der bevæger sig lidt længere end det uskårne plasmid, men langt mindre end indsættelsen.

Trin 10 – Beregn relativ mobilitet af ukendte

Mål afstanden fra brønden til hvert ukendt bånd, divider med sporingsfarveafstanden, og få den relative mobilitet.

Trin 11 – Estimer fragmentstørrelse

Indsæt de relative mobiliteter i ligningen udledt i trin 7 for at beregne den omtrentlige størrelse af hvert fragment.

Ting påkrævet

• Gelbillede i høj opløsning taget under UV-belysning
• Regnearkssoftware (Excel, Google Sheets osv.)
• Lineal eller skydelære til præcis afstandsmåling

TL;DR

Hvis du observerer brede, lyse bånd nær bunden af hver bane, har du sandsynligvis RNA-kontaminering – gennemgå dine oprensningstrin.