Nyt værktøj muliggør visning af spektrum fra specifikke strukturer inden for prøver

Fluorescens er et utrolig nyttigt værktøj til eksperimentel biologi, og det blev bare lettere at få fat i, takket være arbejdet fra en gruppe forskere ved University of Chicago.

Gruppen skabte et nyt værktøj som en del af en laboratorieklasse inden for kandidatuddannelsen Biophysical Sciences ved University of Chicago, gør det muligt for brugerne at nulstille spektret fra specifikke strukturer inden for prøver.

"Hovedparten af ​​arbejdet blev udført af kandidatstuderende i løbet af deres første semester, "sagde Adam Hammond, pensumdirektør og lektor i programmet Biofysiske Videnskaber ved Gordon Center for Integrative Sciences. "Deres entusiasme og kreativitet gjorde dette projekt muligt."

Som gruppen rapporterer i denne uge i journalen Gennemgang af videnskabelige instrumenter , fra AIP Publishing, målet med deres instrumentering er at observere det lysspektrum, der kommer fra en del af en prøve i et mikroskop - men ikke hele prøven.

"Værdien af ​​et mikroskop er, at det giver dig mulighed for at observere variationerne i en prøve, "Forklarede Hammond." Vi ville gerne kunne spørge, 'hvad er spektret fra den specifikke struktur lige der?' Dette er ikke et nyt ønske og instrumenter, der kan gøre det, eksisterer, men ingen, så vidt jeg ved, lige så enkelt som vores. "

I løbet af sit første år på forskerskolen, Peter Dahlberg, første forfatter til artiklen, der nu er ved Stanford University i Californien, kom til at bygge et selektivt excitationsmikroskop. "Ubevidst, Jeg tror, ​​ideen startede dengang, "sagde han." Hvorfor ikke gøre det samme, men omvendt? "

Hvordan fungerer gruppens værktøj? Først, det deler lyset fra en prøve. Halvdelen går til et kamera til normal billeddannelse, og den anden halvdel går til et spektrometer. Men inden det kommer til spektrometeret, at halvdelen passerer gennem et par optiske komponenter, der giver brugerne mulighed for at vælge enhver vilkårlig del af billedet og blokere alt andet.

"Der er ikke noget tricky ved disse optiske komponenter - en rumlig lysmodulator (SLM) mellem krydsede polarisatorer, "Sagde Hammond." SLM'er er almindelige nu, med mindst tre i mange moderne digitale projektorer. De har en række pixels, der hver kan manipulere fasen af ​​lyset, der passerer gennem dem. "

Selvom der er flere tricks, du kan gøre med en SLM, gruppen bruger den mest ligetil.

"Vi fokuserer billedet fra prøven på SLM og flytter kun fasen af ​​de pixels, som vi ønsker at opnå et spektrum fra, "fortsatte han." Det skiftede lys passerer gennem en anden polarisator; alt andet bliver blokeret. Derefter opsamles det lys og kan sendes til enhver form for optisk instrument, du vælger. Lige nu sender vi det til et lille UV/Vis -spektrometer for at få et fuldt spektrum. "

Gruppens instrument er, måske, bedst opsummeret som et "arbejdshesteværktøj". Dens enkle koncepter og komponenter kan let tilpasses til mange forskellige formål og tilføjes til eksisterende mikroskoper let og billigt.

"Vi satte os for at bygge det til en bestemt anvendelse:For at måle spektralskiftet af fluorescerende indikatorer, "Hammond sagde." Vi tænkte ikke rigtig på at gøre det alsidigt eller hvordan vi skulle arrangere SLM og polarisatorer, da vi startede. Men vi havde en underholdende række erkendelser undervejs. "

En sådan erkendelse var, at deres instrument også kunne bruges til absorbansmålinger.

"Tit, de vigtigste prøver er små og svære at oprette eller rense - som krystalformer, "sagde han." Det er et hårdt arbejde at rense de to typer væk fra hinanden i tilstrækkelige mængder til at fylde en kuvette. Når du lægger blandingen på et objektglas, det bliver lettere. Krystaller kan måles én ad gangen, og det kan celler, der udtrykker variable kromoforer (molekyler, der er ansvarlige for farve). Dette åbner et helt nyt område, der ikke var en del af vores oprindelige plan. "

Gruppens instrument kan "tage hele spektret af en eller flere brugerdefinerede områder af interesse og samtidig optage standardfluorescensbilleder af hele synsfeltet, "Sagde Hammond." Så hvad du kan gøre med det, afhænger af prøven. Vi bruger det nu til at følge fluorescerende sonder for pH og calcium. Men et eksempel på en meget anderledes anvendelse er dens evne til at identificere individuelle mikroorganismer i en blandet prøve ved deres absorbans -fingeraftryk. "

Hvad er det næste for forskerne?

"Ved at bruge en pulserende excitationskilde, fluorescenslevetiden for en sonde kunne måles ud fra et udvalgt område af interesse, "sagde Hammond." En interessant potentiel anvendelse er inden for neurovidenskab til løsning af enkeltaktionspotentialer med farvestoffer, der er følsomme over for membranpotentiale. Fluorescens levetid målinger giver en fordel i forhold til direkte fluorescens målinger, fordi de er uafhængige af sondens koncentration. "