Proteinkrystaller dyrket i mikrotyngdekraft kunne give modgift mod nervestoffer

På en lun aften i begyndelsen af ​​juni, Space X opsendte Falcon 9-raketten, som fragtede Dragon-rumfartøjet mod den internationale rumstation (ISS). Da dragen brækkede båndene af Jordens tyngdekraft tre små, sorte kasser var sikkert placeret i dets lastrum. Disse uskadelige kasser rummer et eksperiment, der kan hjælpe forskere med at udvikle nye modgifte mod nervestoffer, der bruges i konfliktzoner.

Hver kasse rummer 30 kamre, hvor krystaller af proteinet, acetylkolinesterase (AChE), vil vokse. Proteinet spiller en central rolle i den normale kommunikation mellem nerveceller samt nerve- og muskelceller i den menneskelige krop. Når AChE ikke er i stand til at fungere, resultaterne er fatale.

AChE hæmmes af en gruppe kemikalier, der almindeligvis findes i pesticider og nervestoffer, kaldet organofosfater. Eksponering resulterer i rystelser, åndedrætslammelse og, uden modgift, død. I hele verden, disse kemikalier er ansvarlige for 200, 000 dødsfald hvert år.

Modgift virker ved at reaktivere AChE-proteinet og feje overskydende toksin ud af kroppen. Den mest almindeligt anvendte FDA-godkendte modgift - Pralidoxim (2-PAM) - frigør organophosphat-molekylet fra AChE-proteinet, som kan vende tilbage til normale funktioner. De få modgift, der er tilgængelige for mennesker, er utilstrækkeligt effektive og langsomme.

"Vi er nødt til at udvikle modgift, der er effektive mod flere slags organofosfater og kan krydse blod-hjerne-barrieren for lettere at reaktivere flere AChE-proteiner, sagde Don Blumenthal, lektor i farmakologi og toksikologi ved University of Utah Health. "Dette er især vigtigt for et scenarie med masseulykker."

Blumenthal var katalysatoren, der samlede et team af eksperter fra hele landet ledet af projektets hovedefterforsker Zoran Radić, lektor ved Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences ved University of California, San Diego (UCSD), i jagten på modgift mod disse frygtelige toksiner.

Ved ankomsten til ISS, astronaut Jack Fisher fandt kasserne og, med et drej på et par håndtag, udsatte kapsler, der indeholder proteinopløsningen, til en cocktail af forskellige salte og buffere i hvert kammer. I løbet af de næste fire måneder, cocktailen vil dehydrere proteinopløsningen, lader AChE-proteinet krystallisere og vokse i rumstationens mikrotyngdekraft.

Navigering i den katalytiske slugt

Forskere begyndte at kortlægge strukturen af ​​AChE-proteinet for flere årtier siden ved hjælp af røntgenkrystallografi. Blumenthal, som har brugt sin karriere på denne teknik, beskriver disse strukturer som blot øjebliksbilleder af proteinets struktur, opfanget ved en kold temperatur, 100 Kelvin (-280 °F). De afslørede en kompleks proteinstruktur med en distinkt, dyb kløft, kaldet den katalytiske kløft, i dets centrum.

"Den katalytiske kløft er som en slot-kløft, " sagde Blumenthal. "Gidedommen har været, hvordan man får organofosfatet og modgiftsmolekylet ind i dette begrænsede rum."

I sin frosne tilstand, kløften kan ikke rumme hverken store molekyler, meget mindre begge dele på samme tid, hvilket har forpurret forskernes forsøg på at udvikle nye modgifte.

Dybt inde i kløften ligger det aktive enzymsted, hvor neurotransmitteren, acetylcholin, nedbrydes og modgift fungerer.

"Det aktive enzymsted har udviklet sig til hurtigt at rumme neurotransmittere, " sagde Radić. "Op til 10, 000 neurotransmittere kan passere ind og ud af enzymstedet hvert sekund."

Organofosfater binder sig til det aktive enzymsted og blokerer nedbrydningen af ​​neurotransmitteren.

"Den eneste forklaring på, hvordan organofosfater og modgift navigerer i kløften, er, at proteinet ånder, sagde Blumenthal.

Mens proteinet faktisk ikke indånder og udånder, forskerne mener, at dens struktur er dynamisk og ændrer form for at rumme store molekyler. Ved hjælp af røntgenstråler, Blumenthal og hans kolleger identificerede placeringen af ​​tunge atomer i proteinstrukturen, men magien bag proteinets bevægelse lå i at kortlægge den nøjagtige placering af de lettere brintatomer, som udgør halvdelen af ​​atomerne i proteinet.

"Typisk, vi har kun vores fantasi til at kortlægge, hvor brintatomerne er i krystalstrukturen baseret på vores kemiske intuition og viden, " sagde Andrey Kovalevsky, R&D-medarbejder i Biology and Soft Matter Division ved Oak Ridge National Laboratory (ORNL). "Dette giver os ikke altid det rigtige svar."

Mens neutronkrystallografi er dyrere, og mindre tilgængelig end røntgenkrystallografi, Kovalevsky er konstant forbløffet over de uventede resultater. Ved at ramme krystallen, neutronstrålen spredes, producerer et diffraktionsmønster, der beskriver placeringen af ​​hvert atom, selv brintatomer, i strukturen.

"De strukturer, der afsløres af neutrondiffraktion, kan fuldstændigt omskrive vores forståelse af kemien bag biologiske processer, fra hvordan enzymer fungerer til den måde lægemidler binder til et mål, " sagde Kovalevsky.

Omgå Jordens forhindringer

Men Kovalevsky blev forhindret. På trods af at have brugt år på at udvikle optimale vækstbetingelser på jordens overflade, ingen cocktail voksede disse proteinkrystaller store nok til at diffraktere neutronstrålen.

"Krystalvækst er en kunst, " sagde Kovalevsky. "Enhver krystallograf kæmper med denne proces for at producere krystaller, der er store nok og stadig af god kvalitet."

Det var da han fik den skøre idé. Send krystallerne ud i rummet.

Hans kolleger var enige.

"Da jeg ankom til Oak Ridge, Jeg lærte om andre videnskabsmænd, der prøvede denne vej og dyrkede bedre krystaller i rummet, " sagde Kovalevsky. Så, han grinte, "At vokse op i Ukraine, Jeg havde aldrig forestillet mig, at jeg ville sende et eksperiment ud i rummet."

Mens krystaller i rummet kun vokser lidt større end deres modstykker på Jorden, de vil vokse længere langs hver dimension af dens tredimensionelle struktur. Som resultat, lydstyrken vil stige dramatisk.

Ud over, de dannes på en mere organiseret måde. En krystal er sammensat af mindre enheder, som samles som byggeklodser i et ensartet mønster. I rummet, disse blokke bringes sammen i et mere regelmæssigt mønster for at danne en bedre krystal.

"Et større volumen og en mere organiseret krystal, " sagde Kovalevsky.  "Det hele er forbundet for at producere et bedre diffraktionsmønster."

Men Kovalevsky var nødt til at klatre. Han havde mindre end et år efter, at hans kolleger sikrede sig en plads på en fremtidig rumflyvning for at re-optimere systemet til at dyrke disse proteinkrystaller inden for rammerne af et rumfartøj.

De krystaller, der vil vende tilbage til Jorden om fire korte måneder, vil være en sammensat krystal, bestående af AChE-proteinet plus en af ​​tre eksperimentelle modgift - to skabt ved UCSD og en bredt testet organofosfatmodgift, MMB4. Kovalevsky vil udsætte disse krystaller for en neutronstråle ved ORNL.

Efter at have søm fast proteinstrukturen, de vil bruge denne information i computersimuleringer til at designe nye molekyler, der kan få adgang til aktiveringsstedet ved bunden af ​​kløften. De vil syntetisere modgiftkandidater og sammenligne deres effektivitet med den nuværende FDA-godkendte behandling, 2-PAM.

Forskerne skal nu spille ventelegen, indtil krystallerne bringes tilbage til Jorden. De forventer, at tilbagevendende rumfartøj vil sprøjte ned i Stillehavet i oktober. De 90 krystaller indeholdt i de små, sorte bokse vil have rejst hundredvis af kilometer fra Jorden til ISS og hjem igen.

"Jo hurtigere vi kan få krystalinformationen, jo hurtigere kan vi begynde at arbejde med at identificere og skabe nye modgifte, sagde Blumenthal.