Superfotostabilt fluorescerende mærkningsmiddel til superopløselig mikroskopi

Kemikere hos ITbM, Nagoya University har udviklet et superfotostabilt fluorescerende farvestof kaldet PhoxBright 430 (PB430) til at visualisere cellulær ultrastruktur ved superopløsningsmikroskopi. Den ekstraordinære fotostabilitet af dette nye farvestof muliggør kontinuerlig STED -billeddannelse. Med sin evne til at mærke proteiner med fluorescerende etiketter, PB430 demonstrerer dets anvendelse i 3-D konstruktion og flerfarvet billeddannelse af biologiske strukturer.

Superopløselig fluorescensmikroskopi, som modtog Nobelprisen i kemi i 2014, giver forskere mulighed for at visualisere biologiske systemer og få en detaljeret forståelse af biomolekylers komplekse dynamik. I særdeleshed, stimuleret emissionsreduktion (STED) mikroskopi bruges i vid udstrækning til at undersøge processer i levende systemer på grund af dens hurtige optagelseshastighed og kompatibilitet med mange biologiske prøver.

Kemikere ved Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM) ved Nagoya University har udviklet et nyt fotostabilt fluorescerende farvestof, PhoxBright 430 (PB430), som muliggør kontinuerlig superopløselig STED-billeddannelse af fluorescensmærkede celler. Da PB430 indeholder en funktionel del, der tillader konjugering med et antistof, specifikke biomolekyle-mål i en celle kan farves ved immunfluorescens. Den usædvanlige fotostabilitet af PB430 tillod forskere at konstruere et 3D-STED-billede af cellulære mikrotubuli og opnå flerfarvet STED-billeddannelse af fluorescerende immunomærkede cytoskeletoner ved at kombinere fotostabile PB430 og kommercielt tilgængelige farvestoffer.

De unikke egenskaber ved PB430 gør det til et kraftfuldt værktøj til at afsløre strukturer og funktioner i celler, og kunne anvendes til den langvarige visualisering af organelles og molekylers bevægelse i cellerne. Resultaterne af denne undersøgelse blev for nylig rapporteret i Journal of the American Chemical Society .

For at opnå høj opløsning i STED -mikroskopi, en biologisk prøve mærket med en fluorofor (et fluorescerende farvestof, der bruges til at mærke biologiske prøver såsom proteiner, væv og celler) bestråles med en fluorescens-excitationsstråle sammen med en doughnut-formet STED-stråle for at undertrykke excitationen af ​​de omgivende molekyler. Selvom det er en kraftfuld teknik, behovet for en højintensitets STED-stråle, som forårsager fotoblegning af farvestoffer, har hæmmet den praktiske brug af STED-mikroskopi i kontinuerlig levende cellebilleddannelse.

Forskere har tidligere rapporteret et fluorescerende farvestof, C-Naphox, som udviser stærk fotostabilitet i STED -billeddannelse. Gruppen har nu optimeret strukturen af ​​C-Naphox og udviklet det nye fotostabile fluorescerende farvestof, som kan bruges til visualisering af strukturer i celler.

"C-Naphox har vist sig at være et ekstremt fotostabilt farvestof til STED-billeddannelse af forskellige materialer, så vi besluttede at justere dens egenskaber yderligere og anvende den til at visualisere ultrastrukturer, "siger Masayasu Taki, en lektor ved ITbM og en af ​​lederne for denne forskning. "Vores nye farvestof, PB430 viser øget opløselighed i vand, fluorescerer effektivt i vandige medier, og er i stand til at mærke antistoffer. Vi var glade for at observere, at den også udviser høj fotostabilitet under STED -forhold, "siger Taki.

Chenguang Wang, en postdoktor i professor Shigehiro Yamaguchis forskningsgruppe ved ITbM, syntetiserede PB430 og udførte STED -billeddannelseseksperimenterne. På lignende måde som C-Naphox, det nye fluorescerende farvestof er luftstabilt og består af et strukturelt forstærket, ringsmeltet, π-konjugeret skelet, der indeholder en phosphol P-oxid enhed, som er oprindelsen til navnet PhoxBright. I stedet for triphenylamindelen, PB430 har en carboxylsyregruppe, der kan konjugeres til antistoffer til immunomærkning via dannelse af en N-hydroxylsuccinimidyl (NHS) ester.

STED-billeddannelseseksperimenter af PB430-konjugerede antistoffer i fikserede HeLa-celler førte til fluorescensbilleder af immunomærkede mikrotubuli, med kun en lille fotoblegning. PB430 fungerede som et fluorescerende mærke for proteiner, og dets fluorescensintensitet blev opretholdt, selv når det var konjugeret.

"Den høje fotostabilitet af PB430 muliggør fluorescensbilleddannelse, som ikke var let muligt med konventionelle farvestoffer, "forklarer Taki." For eksempel, PB430 kan bruges til 3-D-STED-billeddannelse af cytoskelet, fordi den kan modstå den kontinuerlige STED-stråle i z-aksen efter billeddannelse i xy-aksen. "

Desuden, gruppen viste, at PB430 kunne anvendes på flerfarvet STED -billeddannelse ved at udnytte forskellen i fotostabilitet blandt forskellige fluorescerende farvestoffer. De udførte STED -billedeksperimenter af mikrotubuli og vimentin (mellemliggende filamentproteiner) i cytoskeletet, immunomærket med PB430 og Alexa Fluor 430 (et fluorescerende farvestof), henholdsvis. Da Alexa Fluor 430 fotoblegner efter at have taget det første STED -billede, det andet billede viser kun PB430-mærkede mikrotubuli. Ved at trække det første billede fra det andet billede afsløres Alexa Fluor 430-mærkede vimentin-filamenter.

"Som regel, flerfarvet STED -billeddannelse kræver flere excitationslasere og en enkelt STED -laserstråle, men i kombinationen af ​​Alexa Fluor 430 med PB430, vi mangler kun et par excitations- og STED -lasere, " forklarer Taki. "Ved at bruge PB430, vi tror på, at det vil være muligt at udføre flerfarvet STED-billeddannelse med en række forskellige kombinationer af forskellige fluorescerende farvestoffer. Det næste trin er at forbedre farvestoffets cellemembranpermeabilitet for at visualisere funktionerne i mange andre cellestrukturer, "fortsætter han.

"Vores forskning har vist, at den stærke fotostabilitet og fysiologiske kompatibilitet af PB430 muliggør gentagen billeddannelse såvel som 3D-billeddannelse og flerfarvebilleddannelse af celler ved STED-mikroskopi, "siger Yamaguchi." Vi håber, at vi kan anvende vores fluorescerende farvestof til langvarig levende cellebilleddannelse ved hjælp af STED -mikroskopi og enkeltmolekylmikroskopi, for at undersøge forskellige biologiske processer. "