Innovativt mikroskop er klar til at drive optogenetiske undersøgelser

Et nyudviklet mikroskop giver forskere et stærkt forbedret værktøj til at studere, hvordan neurologiske lidelser som epilepsi og Alzheimers sygdom påvirker neuronkommunikation. Mikroskopet er optimeret til at udføre undersøgelser ved hjælp af optogenetiske teknikker, en forholdsvis ny teknologi, der bruger lys til at kontrollere og billedneuroner genetisk modificeret med lysfølsomme proteiner.

"Vores nye mikroskop kan bruges til at undersøge virkningerne af forskellige genetiske mutationer på neuronal funktion, "sagde Adam Cohen fra Harvard University, USA, og lederen af ​​forskergruppen, der udviklede mikroskopet. "En dag kunne den bruges til at teste virkningerne af kandidatlægemidler på neuroner fra mennesker med nervesystemforstyrrelser for at forsøge at identificere medicin til behandling af sygdomme, der ikke har tilstrækkelige behandlinger lige nu."

Det nye mikroskop, kaldet Firefly, kan forestille et område på 6 millimeter i diameter, mere end hundrede gange større end synsfeltet for de fleste mikroskoper, der bruges til optogenetik. I stedet for at studere den elektriske aktivitet af et neuron, det store billeddannelsesområde gør det muligt at udløse de elektriske pulser, neuroner bruger til at kommunikere og derefter se disse pulser bevæge sig fra celle til celle gennem et stort neuralt kredsløb, der indeholder hundredvis af celler. I hjernen, hver neuron forbinder typisk med tusind andre neuroner, så at se det større netværk er vigtigt for at forstå, hvordan neurologiske sygdomme påvirker neuronal kommunikation.

I tidsskriftet The Optical Society (OSA) Biomedicinsk optik Express , Cohen og hans kolleger rapporterer, hvordan de samlede det nye mikroskop for mindre end $ 100, 000 ved hjælp af komponenter, der er næsten alle kommercielt tilgængelige. Mikroskopet viser ikke kun et stort område, men indsamler også lys ekstremt effektivt. Dette giver den høje billedkvalitet og hurtige hastighed, der er nødvendig for at se neuronale elektriske impulser, der hver kun varer en tusindedel af et sekund.

Brug lys til at se neuroner fyre

Det nye mikroskop er ideelt til undersøgelse af menneskelige neuroner dyrket i laboratoriet. I det sidste årti, forskere har udviklet humane cellemodeller til mange lidelser i nervesystemet. Disse celler kan genetisk modificeres til at indeholde lysfølsomme proteiner, der gør det muligt for forskere at bruge lys til at få neuroner til at fyre eller til at kontrollere variabler såsom neurotransmitterniveauer eller proteinaggregation. Andre lysfølsomme fluorescerende proteiner gør de usynlige elektriske impulser fra neuroner til korte fluorescensglimt, der kan afbildes og måles.

Disse teknikker har gjort det muligt for forskere at studere input og output fra individuelle neuroner, men kommercielt tilgængelige mikroskoper er ikke optimeret til fuldt ud at udnytte potentialet i optogenetiske tilgange. For at udfylde dette teknologiske hul, forskerne designede Firefly -mikroskopet til at stimulere neuroner med et komplekst mønster, der indeholder en million lyspunkter og derefter registrere de korte blink af lysfluorescens, der svarer til elektriske pulser, der affyres af neuronerne.

Hver pixel af lysmønsteret kan uafhængigt stimulere et lysfølsomt protein. Fordi pixels kan have mange forskellige farver, forskellige typer lysfølsomme proteiner kan udløses på én gang. Lysmønsteret kan programmeres til at dække en hel neuron, stimulere visse områder af en neuron eller bruges til at belyse flere celler på én gang.

"Dette optiske system giver en million input og en million output, giver os mulighed for at se alt, hvad der foregår i disse neurale kulturer, "forklarede Cohen.

Efter at have stimuleret neuronerne, Mikroskopet bruger et kamerabillede med tusinde billeder i sekundet til at fange fluorescensen forårsaget af de ekstremt korte elektriske pulser. "Det optiske system skal være yderst effektivt til at detektere gode signaler inden for et millisekund, "sagde Cohen." En masse teknik gik til at udvikle optik, der ikke kun kan forestille sig et stort område, men kan gøre det med meget høj lysindsamlingseffektivitet. "

For effektivt at opsamle lys over et stort område, Firefly-mikroskopet bruger en objektivlins på størrelse med en sodavandsdåse i stedet for den tommelfingerformede objektiv, der bruges af de fleste mikroskoper. Forskerne brugte også en optisk opsætning, der øger mængden af ​​lys, der stimulerer neuronerne, for at sikre, at neuronerne udsender lys fluorescens, når de fyres.

"Det ene brugerdefinerede element i mikroskopet er et lille prisme placeret mellem neuronerne og objektivlinsen, "forklarede Cohen." Denne vigtige komponent får lyset til at bevæge sig langs det samme plan som cellerne frem for at komme ind i prøven vinkelret. Dette holder lyset fra at belyse materiale over og under cellerne, faldende baggrundsfluorescens, der ville gøre det svært at se fluorescens faktisk komme fra neuronerne. "

Ser 85 neuroner på én gang

Forskerne demonstrerede deres nye mikroskop ved at bruge det til optisk at stimulere og registrere fluorescensen fra dyrkede humane neuroner. "Neuronerne var et stort sammenfiltret rod af spaghetti, "sagde Cohen." Vi viste, at det var muligt at løse 85 individuelle neuroner på samme tid i en måling, der tog omkring 30 sekunder. "

Efter den første stimulering og billeddannelse, forskerne var i stand til at finde 79 af de 85 celler en anden gang. Denne kapacitet er vigtig for undersøgelser, der kræver, at hver celle skal afbildes før og efter udsættelse for et lægemiddel, for eksempel.

I en anden demonstration, forskerne brugte mikroskopet til at kortlægge de elektriske bølger, der formerer sig gennem dyrkede hjerteceller. Dette viste, at mikroskopet kunne bruges til at studere unormale hjerterytmer, som opstår, når de elektriske signaler, der koordinerer hjerteslag, ikke fungerer korrekt.

"Det system, vi udviklede, er designet til at se på en relativt flad prøve, f.eks. Dyrkede celler, "sagde Cohen." Vi udvikler nu et system til at udføre optogenetiske tilgange i intakt væv, hvilket ville give os mulighed for at se på, hvordan disse neuroner opfører sig i deres oprindelige kontekst. "

Forskerne har også startet et biotekfirma ved navn Q-State Biosciences, der bruger en forbedret version af mikroskopet til at arbejde med farmaceutiske virksomheder om opdagelse af lægemidler.