Visualisering af enkeltmolekyler i hele celler med et nyt spin

Cellebiologer bruger traditionelt fluorescerende farvestoffer til at mærke og visualisere celler og molekylerne i dem under et mikroskop. Med forskellige superopløsningsmikroskopimetoder, de kan endda oplyse enkeltmolekyler og deres komplekse interaktioner med hinanden. Imidlertid, mikroskopi -hardware, der giver dem mulighed for at gøre dette, er meget specialiseret og dyrt og derfor relativt sjælden i laboratorier rundt om i verden, og driften af ​​sådanne mikroskoper er skræmmende, da det kræver unikke færdigheder.

Ralf Jungmann, Ph.d., en alumn fra Harvards Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering og i øjeblikket professor ved Ludwig Maximilian University (LMU) og Max Planck Institute (MPI) of Biochemistry i Tyskland og Wyss Institute Core Faculty -medlem Peng Yin, Ph.d., har udviklet DNA-PAINT, en kraftfuld molekylær billeddannelsesteknologi, der involverer forbigående DNA-DNA-interaktioner for nøjagtigt at lokalisere fluorescerende farvestoffer med superopløsning. Imidlertid, selvom forskerne har demonstreret DNA-PAINTs potentiale ved at visualisere enkelte biomolekyler, såsom proteiner, i faste celler på en fast tæt afstand, teknologien kunne endnu ikke anvendes til at undersøge molekyler dybt inde i celler.

Nu, Jungmanns og Yins teams rapporterer i fællesskab om en løsning for at overvinde denne begrænsning. I deres nye undersøgelse, de tilpassede DNA-PAINT-teknologien til mikroskoper, der er udbredt blandt cellebiologiske laboratorier, kaldet konfokale mikroskoper, og som bruges af forskere til at forestille hele celler og tykkere væv ved lavere opløsning. MPI/Wyss Institute -teamet demonstrerer, at metoden kan visualisere en række forskellige molekyler, herunder kombinationer af forskellige proteiner, RNA'er og DNA i hele dybden af ​​hele celler ved superopløsning. Udgivet i Naturkommunikation , tilgangen kunne åbne døren for detaljerede enkeltmolekylære lokaliseringsundersøgelser på mange områder af celleforskning.

DNA-PAINT-metoden knytter en DNA "ankerstreng til molekylet af interesse. Derefter vedhæftes en farvestofsmærket DNA" billedstreng "med en komplementær sekvens forbigående til ankeret og frembringer et fluorescerende signal, som forekommer som en defineret blinkende hændelse på enkelte molekylære steder. Fordi "blinkende" præcist kan indstilles, molekyler, der kun er nanometer fra hinanden, kan skelnes-i den højere opløsning af en superopløsning.

"Vores nye tilgang, SDC-MALING, integrerer de alsidige superopløsningsfunktioner i DNA-PAINT med de optiske snitfunktioner i konfokale mikroskoper. Vi skabte således midlerne til at udforske hele cellens dybde, og at visualisere molekylerne indeni det i nanometerskalaen, "sagde Jungmann. Teamet kortlagde tilstedeværelsen af ​​forskellige kombinationer af proteiner i hele celler og gik derefter ud over det." Ved at diversificere vores mærkningstilgange, vi visualiserede også forskellige typer af individuelle biomolekyler i den kromosomholdige kerne, herunder sekvenser i DNA'et, proteiner bundet til DNA eller membranen, der omslutter kernen, samt nukleare RNA'er, "tilføjer Yin, som også er medleder for Wyss Institutes Molecular Robotics Initiative, og professor i systembiologi ved Harvard Medical School. .

I princippet, Konfokale mikroskoper bruger såkaldte pinholes til at fjerne uønsket fluorescens uden for fokus fra billedplaner over og under brændplanet. Ved at scanne gennem prøven, fly efter fly, forskere kan samle fluorescenssignaler udsendt fra molekylbundne farvestoffer over hele dybden. Specifikt, MPI/Wyss Institute -teamet udviklede teknikken til "Spinning Disk Confocal" (SDC) mikroskoper, der detekterer fluorescenssignaler fra et helt plan på én gang ved at registrere dem gennem en roterende skive med flere pinhuller. I øvrigt, "for at opnå 3D superopløsning, vi placerede en ekstra linse i detekteringsvejen, som giver os mulighed for at arkivere sub-diffraktionsbegrænset opløsning i den tredje dimension "sagde første forfatter Florian Schueder, en kandidatstuderende, der arbejder med Jungmann, der også arbejdede sammen med Yin's Wyss Institute -team som en del af sin kandidatafhandling.

"Denne tilføjelse kan let tilpasses af producenter af SDC-mikroskoper; så vi implementerer grundlæggende superopløselig mikroskopi uden komplekse hardwareændringer i mikroskoper, der generelt er tilgængelige for cellebiologer fra alle steder i biomedicinsk forskning. Fremgangsmåden har således potentiale til at demokratisere super -resolution imaging i hele celler og væv, sagde Jungmann.

"Med dette vigtige fremskridt, superopløselig mikroskopi og DNA-PAINT kunne blive mere tilgængelig for biomedicinske forskere, fremskynde vores indsigt i de enkelte molekylers funktion og de processer, de kontrollerer inden for celler, "sagde Wyss Institutes grundlægger, Donald Ingber, M.D., Ph.d., som også er Judah Folkman professor i vaskulær biologi ved HMS og vaskulærbiologiprogrammet på Boston Children's Hospital, samt professor i bioingeniør ved SEAS.