Vigtig biomedicinsk mikroskopi teknik kan nu billede dybere ind i væv

En nyligt udviklet teknik kendt som lysarkfluorescensmikroskopi har ført til mange biologiske opdagelser ved at tillade forskere at oprette 3D-billeder af væv, endda levende dyreembryoner, ved hjælp af fluorescerende mærker. Nu, forskere rapporterer evnen til at øge billeddybden af ​​lysarkfluorescensmikroskopi ved hjælp af et optisk fænomen kendt som tre-fotonabsorption.

I tidsskriftet The Optical Society (OSA) Optik bogstaver , forskerne rapporterer detaljeret, hvordan tre-fotonabsorption kan bruges med lysarkfluorescensmikroskopi til billede dybere ind i væv. Som en demonstration, de brugte den kombinerede teknik til at producere klare billeder gennem en kugle af dyrkede celler, kendt som en kugleformet, omkring 450 mikrometer i diameter.

"Denne demonstration er meget vigtig, da den imødekommer et uopfyldt behov for bedre billeddannelse i dybden, som kunne hjælpe forskere med at få bedre data om biologiske processer, "sagde forskerteamleder, Kishan Dholakia fra University of St. Andrews i Storbritannien "Denne fremgangsmåde kan især være nyttig til neurovidenskab og udviklingsbiologiske undersøgelser og kan finde anvendelse i billeddannelse af flere prøver på en automatiseret måde til opdagelse af lægemidler."

Det lys, der er nødvendigt til billedfluorescerende etiketter, kan være skadeligt og endda dødeligt for sarte biologiske prøver, såsom hjernevæv eller dyreembryoer, der bruges til at studere udviklings- og sygdomsprocesser. Lysarkfluorescensmikroskopi muliggør hurtig, billedbehandling i høj opløsning med lidt optisk skade, fordi den belyser en prøve med kun et tyndt lysark; andre dele af prøven får ikke unødig lyseksponering.

"Vi forventer, at lysfluorescensmikroskopi med tre foton vil have stor indflydelse på billeddannelse af hjernen hos gnavere som mus og rotter, hvor det kunne bruges til at fange billeder med meget bredt felt med subcellulær opløsning, "sagde avisens første forfatter Adrià Escobet-Montalbán.

Dybere billeddannelse

Forskerne ønskede at sammenligne tre-foton lysark-fluorescensmikroskopi med den tidligere anvendte to-fotonabsorption. Ved multiphotonabsorption, den fluorescerende etiket afgiver lys efter at have absorberet, eller at blive begejstret for, to eller tre fotoner frem for den ene foton, der bruges til at producere traditionel fluorescens.

Multiphotonabsorption reducerer lys ude af fokus og minimerer lys, der kan skade prøven, fordi den bruger længere bølgelængder, som spredes mindre af væv, og ved at begrænse excitationslyset til et lille volumen. Når tre fotoner bruges til at producere fluorescens frem for to, disse fordele forstærkes.

For at demonstrere deres nye teknik, forskerne brugte en standard optisk opsætning til lysarkfluorescensmikroskopi med en pulserende laser, der traditionelt bruges til to-foton excitation. Selvom denne laser ikke var den mest passende til at skabe effektiv tre-foton excitation, det var ideelt til sammenligning af to-foton og tre-foton excitation.

Forskergruppen afbildede sfæroider af humane embryonale nyreceller ved hjælp af to-foton og tre-foton excitation. I nærheden af ​​sfæroidens overflade, begge billeddannelsesmetoder udført på samme måde. Imidlertid, på den yderste side af sfæren, billedkvaliteten for tre-foton lysark-fluorescensmikroskopi bevarede billedkontrast, mens kvaliteten af ​​to-foton billedet faldt betydeligt.

Optimering af teknikken

For yderligere at forbedre dybdebilleddannelsen og synsfeltet, forskerne eksperimenterede med at ændre laserens intensitetsprofil til en Bessel -stråle, som har en central, lys kerne omgivet af koncentriske ringe, frem for den traditionelle solide gaussiske laserstråle som en laserpeger.

"Bessel-stråler kan bruges i to-foton lysark-tilstand, men kan give potentielle artefakter på grund af deres koncentriske ringe, "sagde medforfatter Federico Gasparoli." For første gang, vi viser numerisk og eksperimentelt, at disse problemer undertrykkes i tre-foton lysarkfluorescensmikroskopi, og at strålen går endnu dybere, gør denne tilgang meget attraktiv. "

Næste, forskerne planlægger at forbedre teknikken ved at bruge lasersystemer ved længere bølgelængder, der er specielt designet til tre-fotonabsorption. Dette bør muliggøre billeddannelse på øget dybde. Parallelt, forskerne arbejder på at udvikle måder at registrere lyset fra fluorescerende etiketter dybt inde i prøver.