Optoakustisk mikroskopi ved flere diskrete frekvenser

Skematisk repræsentation af hybridmikroskopisystemet indeholdende et undersystem til optoakustisk mikroskopi med dobbelt bølgelængde ved 488 nm og 808 nm, co-aligned med et subsystem til multifotonmikroskopi ved 1043 nm. a) AMP forstærker, CCD lysfeltskamera, DAQ dataopsamlingskort, DM dikroisk spejl, GC galvanometrisk spejlcontroller, IQD IQ demodulator, LO1 lokaloscillator 1, LO2 lokaloscillator 2, NDF neutrale densitetsfiltre, OA optoakustisk, AF optisk filter, PC personlig computer, PH nålehul, PMT fotomultiplikatorrør, SHG anden-harmonisk generation, THG tredje harmoniske generation, TPEF to-foton excitationsfluorescens, xyz motoriserede trin. b) Spektret af excitations- og detektionsbølgelængder i hybrid FDOM/multiphoton (MP) billeddannelse. c) Skematisk sammenligning mellem tidsdomæne (TD) optoakustisk mikroskopi, som bruger korte lysimpulser, og frekvensdomæne (FD) optoakustisk mikroskopi, som er baseret på laserintensitet moduleret ved flere diskrete frekvenser. Kredit: Lys:Videnskab og applikationer . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2

Optoakustisk billeddannelse drevet af korte udbrud af kontinuerlige bølgelasere (CW) kan stimulere emissionen af ultralydsbølger inde i et dyr eller hos mennesker. Metoden kan ikke-invasivt fange blodgennemstrømning og producere 3-D-billeder af cellulær mikroarkitektur. Skriver ind Lys:Videnskab og applikationer , Stephan Kellnberger og kolleger ved Institute of Biological and Medical Imaging, Rapporter nu muligheden for at opnå optoakustiske high-fidelity-billeder med omkostningseffektive lasere styret ved flere frekvenser.

Forfatterne demonstrerede eksperimentelt den multiple frekvens-baserede, high-fidelity billedgenerering af biologisk arkitektur ved at afbilde fisk og musevævs mikrovaskulatur. I billeddiagnostiske eksperimenter, de overlejrede strukturelle detaljer, der kun dukkede op ved specifikke frekvenser af interesse. Forfatterne identificerede også ikke-invasivt blodgennemstrømningshastigheden i vævsmikrovaskulatur ved at spore frekvensskiftene ved hjælp af den optoakustiske Doppler-effekt.

Optoakustisk (fotoakustisk) registrering kræver normalt komplekse laserteknologier. Sådanne teknikker kan generere nanosekunders længde (1-100 ns), højenergi korte fotonimpulser, der konventionelt belyser transient (kortvarig) energi i tidsdomænet (TD). De ultrakorte pulser kan stimulere emissionen af bredbånds ultralydsbølger, opsamlet i mikrosekundområdet for at danne optoakustiske billeder. Imidlertid, kompleks laserteknologi kan pålægge en lav-puls-gentagelsesfrekvens (PRF) og begrænse antallet af bølgelængder, der er tilgængelige på samme tid til spektral billeddannelse. For at undgå sådanne grænser, Kellnberger et al. udviklet frekvensdomæne optoakustisk mikroskopi (FDOM), hvor lysintensiteten kan styres eller moduleres ved flere diskrete frekvenser ved hjælp af omkostningseffektiv hardware.

Forklaring af frekvenskodning i dobbelt bølgelængde FDOM. a) Forenklet skematisk af frekvenskodning på forskellige bølgelængder. Laserkilde 1, der udsender ved λ1 =488 nm, blev belastet med den laveste modulationsfrekvens f1, mens laserkilde 2, der udsender ved λ2 =808 nm, blev belastet med den højeste modulationsfrekvensafvigelse. Under billeddannelse, vi øgede moduleringen af bølgelængden λ1 og reducerede modulationsfrekvensen af λ2 i trin af fstep ved hjælp af ulige antal moduleringsfrekvenser. b) Skematisk repræsentation af flere modulationsfrekvenser, der bruges til billeddannelse, viser superpositionen af frekvenser ved to bølgelængder. Kredit: Lys:Videnskab og applikationer . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2

Så langt, optoakustisk billeddannelse har kun været afhængig af teknikker, der detekterer signaler i tidsdomænet (TD) eller dem, der kun scanner en enkelt frekvens ved en eller to bølgelængder i frekvensdomænet (FD). Denne undersøgelse var den første til at udføre in vivo optoakustisk billeddannelse i en dyremodel via samtidig belysning med to bølgelængder.

Forskerne kombinerede FDOM til et hybridsystem for at undersøge forholdet mellem billeddannelse og frekvenskontrol. Brugen af diskrete frekvenser (maksimalt ni), tilladt ikke-invasive optoakustiske Doppler-skiftmålinger som flowobservationer i et mikrofluidisk flowkammer i laboratoriet først, og i vævsmikrovaskulatur in vivo derefter. I undersøgelsen, Kellnberger et al. brugte to CW-diodelasere, der udsender lys ved 488 nm og 808 nm til belysning.

Forskerne implementerede FDOM, opererer i frekvensområdet 5-50 MHz, som et hybridsystem med multifoton (MP) mikroskopi, der opererer ved 1043 nm. De udførte derefter to-/tredimensionel billeddannelse baseret på ultralyds amplitude- og fasemålinger ved flere frekvenser. Amplituden og fasen af de genererede optoakustiske signaler blev løst via demodulation i realtid og optaget ved hjælp af en analog-til-digital konverter. På grund af høje gentagelsesrater, FDOM opnåede høje signal-til-støj-forhold (SNR), fører til de observerede high-fidelity-billeder. I alt, undersøgelsen undersøgte forholdet mellem modulationsfrekvensen, billedgengivelse og signal-til-støj-forholdet (SNR).

Enkeltbølgelængde FDOM-billeddannelse af en sutur og ex vivo zebrafiskprøver. a) En skematisk illustration af scanningen af to krydsende suturer. b) Farvekodede FDOM-billeder af to 50 µm suturer, baseret på belysning ved 488 nm og modulationsfrekvenser på 10, 20, 30, og 40 MHz. Farvefrekvens-rumrepræsentationen (FSR) overlejrer bidragene fra hver modulationsfrekvens. Gråskala-FSR-billedet baseret på fire frekvenser viser det endelige billede. c) Tværsnitsprofil af den stiplede linje vist i panel b, som sammenligner kontrasterne afsløret af de forskellige modulationsfrekvenser. d) Ex vivo billeddannelse af en zebrafisklarveøjeæble. Det lilla billede blev rekonstrueret ved hjælp af lave (L) frekvenser (10, 15, og 20 MHz); det grønne billede ved hjælp af midterste (M) frekvenser (25, 30, og 35 MHz); og det røde billede ved hjælp af høje (H) frekvenser (40, 45, og 50 MHz). Den farvekodede overlejring af alle frekvenser (FSR, 10 til 50 MHz) fremhæver bidraget fra hver spektral region. e) Orange farve viser amplitudesummen for de ni anvendte modulationsfrekvenser. f) Et lysfelt billede af et zebrafiskøje, validering af pålideligheden af FDOM-billeder. g) En sammenligning af signal-til-støj-forhold (SNR'er) af billeder af to krydsende suturer (40 µm diameter) opnået via FD og TD optoakustisk mikroskopi. FDOM-billedet gav en SNR på ~35 dB. h) Under lignende eksperimentelle indstillinger, TD-mikroskopi resulterede i en SNR på ~29 dB. Kredit: Lys:Videnskab og applikationer . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2

For at identificere egenskaberne ved FD fotoakustisk billeddannelse, forskerne afbildede et par krydsede suturer i vand ved to bølgelængder (488 nm og 808 nm) og diskrete modulationsfrekvenser. Superpositionen af forskellige frekvensbidrag bar information om det afbildede objekt (suturer).

For at udtrække information fra mere komplekse strukturer, Kellnberger et al. afbildede øjet af 5 dage gammel vildtype zebrafisk lava ex vivo, ved hjælp af ni modulationsfrekvenser, der spænder over 10-50 MHz i 5-MHz-trin. Forskerne sammenlignede også SNR (signal-til-støj-forhold) mellem FDOM-metoden og konventionel TD, som varierede i henhold til eksperimentelle parametre (laserenergi, strømforbrug og dataindsamlingshardware).

Multifrekvens-amplitude- og fasedata kunne således behandles til 3-D-billedrekonstruktion ved hjælp af en Fourier-transformation baseret på frekvens-rum-repræsentation (FSR) og tid-rum-repræsentation (TSR). Sammenlignet med TSR, den FSR-baserede billedrekonstruktion var beregningsmæssigt hurtigere og krævede ikke datainversion under billedrekonstruktion.

Enkelt- og dobbeltbølgelængde FDOM-billeddannelse af et museøre in vivo. a) FDOM-billeddannelse ved 488 nm. Cyan farve repræsenterer det rekonstruerede billede, fra ni lige store frekvenser i intervallet 10 til 50 MHz. b–d) Individuelle billeder opnået ved modulationsfrekvenser på 10, 30, og 50 MHz, som afbilder strukturerne i den stiplede boks i panel a. e) SNR som funktion af n frekvenser, der blev brugt til FSR-rekonstruktion. En asymptotisk forbedring observeres for n > 8 diskrete frekvenser. f) Et profilbillede af den stiplede boks i panel a, som er afgrænset af en hvid stiplet pil. Det demonstrerer forholdet mellem modulationsfrekvens og billedopløsning. Gule kryds fremhæver billedopløsningen som en funktion af moduleringsfrekvensen:hurtigere modulation (50 MHz) kan klart løse små strukturer, selv ned til 4 µm, mens langsommere modulation (10 MHz) ikke kan. g–l) Hybrid FDOM/multifoton billeddannelse af et museøre efter injektion af melanomceller. g) Et overlejringsbillede, der blev opnået ved hjælp af fire etiketfri mikroskopimodaliteter:FDOM ved 488 nm og 808 nm, SHG ved 522 nm, og THG ved 348 nm. h) Et lysfeltbillede, der validerer resultaterne, der blev opnået via hybridmikroskopi; MC, melanomceller. i) FDOM-billeddannelse ved 488 nm, der viser vaskulatur og melanomceller. j) Et FDOM-billede ved 808 nm, der viser B16F10 melanomceller injiceret i museøret. k) Et SHG-billede, der viser kollagenfordelingen i epidermis. l) Et THG-billede, der viser vævsmorfologien; overvejende keratinocytter og hårsække. Kredit: Lys:Videnskab og applikationer . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2

For FDOM-baseret in vivo vævsbilleddannelse, forskerne observerede øret på en bedøvet mus. De opnåede artefaktfrie billeder med flere modulationsfrekvenser, der matchede rumlige frekvenser af det afbildede objekt. Forskerne brugte maksimalt ni frekvenser i undersøgelsen. Billedets SNR steg fra ~14 dB ved en enkelt frekvens til ~30 dB ved ni frekvenser for skarpere billeder.

De observerede derefter et museøre indeholdende murine metastatiske melanomceller in vivo som før via synkroniseret excitation af to bølgelængder (488 nm og 808 nm) ved separate modulationsfrekvenser. Ved at bruge kombineret optoakustisk og optisk mikroskopi, Kellnberger og kolleger var i stand til effektivt at afbilde vævstræk (dvs. vaskulatur, melanom celler, kollagen og keratinocytter) uden konventionelle fluorescerende mærker eller mærker.

Kellnberger et al. udførte derefter FD mikro-Doppler (µDoppler) målinger med opsætningen for første gang i et museøre til optoakustisk billeddannelse af mikrocirkulatorisk blodgennemstrømning in vivo. Før de påtænkte målinger udføres, forskerne brugte sorte kulstofpartikler ved varierende cirkulationshastigheder i en mikrofluidisk chip til at validere den eksperimentelle opsætning. µDoppler FDOM blev anvendt til at generere et kort over mikrocirkulation i et museøre derefter. Den mikrocirkulatoriske blodstrøm afslørede gradvist stigende hastighed fra karkanten til kernen.

Optoakustisk billeddannelse af mikrocirkulatorisk blodgennemstrømning i et museøre in vivo. a Et skema for µDoppler-detektionsopsætningen. FL1− flow 1 væk fra den amerikanske sensor, FL2− flow 2 væk fra den amerikanske sensor (FL2− < FL1−), FL1+ flow 1 mod den amerikanske sensor, I strømningsretning ind i chippen, MC mikrofluidisk chip, OL objektiv linse, P partikler, amerikansk ultralyd, UT ultralydstransducer, fmod modulationsfrekvens, OUT strømningsretning ud af chippen. Nærbillederne illustrerer den eksperimentelle påvisning af partikler, der bevæger sig væk fra ultralydssensoren, hvilket svarer til et Doppler rødt skift. b-d Gennemsnitlige frekvensspektre opnået ved strømningshastigheder på 0 mm·s−1 (grøn), 0,3 mm·s−1 (rød), eller 1,3 mm·s−1 (rød). De sidstnævnte to strømningshastigheder viser respektive røde skift på 2 Hz og 7 Hz fra modulationsfrekvensen, fordi partikler flyder væk fra transduceren. e Doppler-skift målt fra kulstofpartikler som funktion af strømningshastigheden i en mikrofluidisk chip. Den sorte linje viser en lineær tilpasning til dataene. f En maksimal intensitetsprojektion af et område af interesse (ROI) med størrelsen 160 × 160 µm² i musens øre, som viser mikrovaskularisering. Målestok, 30 µm. g Et Doppler FDOM-flow-kort, der blev registreret i samme ROI, viser en topamplitude af det registrerede flow i blodkarrene. h, i En blanding og en overlejring af Doppler-flowkortet g og det optoakustiske billede f, som viser topamplituder som Doppler røde og blå skift i forhold til transducerens position. j En overlejring af Doppler-kort med rød- og blåskift på den galvanometriske scanning i panel f. Hvide pile angiver de udledte retninger af blodgennemstrømning i forskellige kar. k En profilscanning på tværs af en enkelt kapillar i den position, der er angivet af de hvide pile i den galvanometriske scanning i panel g. Den røde linje repræsenterer en parabolsk tilpasning til de registrerede Doppler-skiftdata med en maksimal blodgennemstrømningshastighed på 0,44 mm·s−1. Den grå faste kurve viser topamplituderne ved hver måleposition. Kredit: Lys:Videnskab og applikationer . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2.

På denne måde undersøgelsen demonstrerede brugen af frekvensdomæne optoakustisk mikroskopi (FDOM) baseret signaldetektion og demodulation for første gang. Forskerne fangede signaler af amplitude og fase ved flere frekvenser af det afbildede objekt. Den kollektive eksperimentelle opsætning indeholdt billige lyskilder, samtidig multibølgelængdebelysning og direkte Doppler-baserede flowmålinger. I fremtidige undersøgelser, Kellnberger et al. vil kvantificere modulationsfrekvenserne, billeddybden og øge billedopløsningen ved hjælp af en forbedret eksperimentel opsætning.

Sidste artikelForskere opdager en proces, der stabiliserer fusionsplasmaer

Næste artikelSådan bygger du en 3-D-printet partikelfælde med gratis CERN-skemaer