MATRIEX-billeddannelse:Ser samtidig neuroner i aktion i flere områder af hjernen

To-foton laser scanning mikroskopi billeddannelse er almindeligt anvendt til at studere neuronal aktivitet ved cellulære og subcellulære opløsninger i pattedyrs hjerner. Sådanne undersøgelser er endnu begrænset til en enkelt funktionel region af hjernen. I en nylig rapport, Mengke Yang og kolleger ved Brain Research Instrument Innovation Center, Institut for Neurovidenskab, Center for Systems Neuroscience og Optical System Advanced Manufacturing Technology i Kina, Tyskland og Storbritannien udviklede en ny teknik med navnet multiarea to-foton real-time in vitro explorer (MATRIEX). Metoden tillod brugeren at målrette mod flere regioner i den funktionelle hjerne med et synsfelt (FOV), der er cirka 200 µm i diameter, for at udføre to-foton Ca ²⁺ billeddannelse med enkeltcelle opløsning samtidigt på tværs af alle regioner.

Yang et al. udført realtids funktionel billeddannelse af enkelt-neuronaktiviteter i den primære visuelle cortex, primær motorisk cortex og hippocampus CA1-region under bedøvede og vågne tilstande hos mus. MATRIEX -teknikken kan entydigt konfigurere flere mikroskopiske FOV'er ved hjælp af en enkelt laserscanningsenhed. Som resultat, teknikken kan implementeres som et ekstra optisk modul inden for eksisterende konventionel enkeltstrålescanning, to-foton mikroskoper uden yderligere modifikationer. MATRIEX kan anvendes til at udforske multiarea neuronal aktivitet in vivo til hjerneomfattende neurale kredsløbsfunktion med enkeltcellet opløsning.

To-foton lasermikroskopi opstod i 1990'erne for at blive populær blandt neurovidenskabsmænd, der var interesseret i at studere neurale strukturer og funktioner in vivo. En stor fordel ved to-foton og tre-foton billeddannelse til levende hjerner inkluderer den optiske opløsning, der opnås på tværs af tæt mærket hjernevæv, der stærkt spreder lys, hvor optisk sektionerede billedpixel kan scannes og optages med minimal krydstale. Imidlertid, fordelene forårsagede også betydelige ulemper ved metoden ved at forhindre samtidig visning af to objekter inden for en bestemt afstand. Forskere havde tidligere implementeret mange strategier for at udvide grænserne, men metoderne var vanskelige at implementere i neurovidenskabslaboratorier. Alligevel, der eksisterer en stadig større efterspørgsel inden for neurovidenskab for at undersøge hjerneomfattende neuronale funktioner med enkeltcellet opløsning in vivo.

I en ligetil tilgang, forskere kan placere to mikroskoper over den samme dyrehjerne for at afbilde cortex og cerebellum samtidigt. Men en sådan indsats kan føre til betydelige stigninger i kompleksitet og omkostninger. De eksisterende høje forventninger til ydeevne og gennemførlighed stiller derfor et meget udfordrende ingeniørspørgsmål om, hvordan et enkelt billeddannelsessystem samtidigt kan opnå levende mikroskopiske billeder fra flere hjerneregioner in vivo. For at løse spørgsmålet, Yang et al. introducerede en ny metode, der kombinerede to-trins forstørrelse og multi-akse optisk kobling.

De indså metoden ved hjælp af et tørt objektiv med lav forstørrelse (DO), med flere vand-nedsænket, miniaturiserede mål (MO'er) under det tørre mål. Forskerne placerede hver af MO'erne i den ønskede målposition og dybde i hjernevævet. Holdet brugte den nye sammensatte objektsamling på samme måde som det originale vand-nedsænkede mikroskopobjektiv uden yderligere ændringer af billedscannings- og optagelsesundersystemet.

Forskerholdet samlede først MATRIEX sammensatte mål. For det, de erstattede det konventionelle vand-immersionsmikroskopobjektiv med en tilpasset sammensat objektivsamling, inde i et to-foton laser scanning mikroskop udstyret med en konventionel enkelt-stråle raster scanning enhed. Den sammensatte samling indeholdt flere MO'er (miniaturiserede objekter) indsat gennem flere kraniotomier, hvor forskerne limede et 3-D trykt plastkammer til kraniet af musemodellen. Kammeret justerede nogenlunde MO'erne med den samme plads for at justere lateral position og dybde. Yang et al. manipulerede præcist de individuelle MO'er til at se objekterne under alle MO'er samtidigt i samme billedplan.

De implementerede MATRIEX -metoden ved hjælp af to principper; to-trins forstørrelse og multiaksekobling. For eksempel, ved at bruge to-trins forstørrelse med det tørre objektiv (DO) alene, de observerede 20 µm perler som små uskarpe prikker, mens de observerede skarpe, runde cirkler gennem den sammensatte samling. Under multiaksekobling, forskerne koblede en enkelt DO med flere MO'er på samme billedplan. Ved at bruge en simpel rasterscanning i en enkelt rektangulær ramme, forskerholdet erhvervede et rektangulært billede indeholdende flere cirkulære FOV'er (Field of Views) - hvor hver FOV svarede til en MO med minimal inter-FOV pixel krydstale.

Forskerne krediterede forstørrelsen af ​​den numeriske blænde (NA) for at muliggøre bedre opløsning med den sammensatte samling. De tilhørende linser var også fleksible og specialdesignede til masseproduktion til lave omkostninger for at hjælpe eksperimentelt design. Hovedtrækket ved MATRIEX var dets kapacitet til at billede flere objekter samtidigt med store dybdeintervaller. For at fremhæve dette, Yang et al. designet forskellige MO'er med forskellige parametre, placere dem på en bestemt dybde, hvor de tilsvarende objektplaner konjugerede på den samme akse. I praksis, forskerholdet kompenserede mindre uoverensstemmelser mellem den ønskede og faktiske objektdybde ved at justere MO'er individuelt langs hver af z-akserne.

Typisk, under DO (tør objektiv) er den maksimale laterale størrelse af målzonen begrænset af den maksimale størrelse af scanningsfeltet. For eksempel, ved at bruge en DO med en 2x forstørrelse og målzone på 12 mm i diameter, forskere kan forestille sig en hel voksen musehjerne. I dette studie, Yang et al. samtidig afbildede den frontale association cortex og cerebellum af musen. I praksis, et 4x luftmål var egnet til at opnå bedre opløsning for at observere fine dendritstrukturer.

Som et principbevis, forskergruppen brugte MATRIEX til at udføre samtidig to-foton Ca ²⁺ billeddannelse af fluorescensmærkede neuroner i den primære visuelle cortex (V1-region), primær motorisk cortex (M1-region) og hippocampus CA1-region hos mus. I konfigurationen af ​​de tre MO'er, forskerne placerede to MO'er, der er egnede til V1- og M1 -regionen, direkte over cortex og indsat en MO inden for hippocampus CA1 -regionen efter kirurgisk fjernelse af et kortikalvæv. Holdet designede derefter linserne til objektplanerne svarende til V1, M1 og CA1 til konjugering på det samme billedplan. Ved hjælp af et to-foton mikroskop udstyret med en 12 kHz resonansscanner, forskerne scannede det fulde billede for at observere tre FOV'er og deres enkelte celler efter at have forstørret de tre forskellige sektioner for at opløse enkelte neuroner. Derefter bemærkede de laserkraften, der skal fordeles mellem flere FOV'er.

Mens Yang et al. kunne have opnået disse resultater ved hjælp af konventionel enkelt-FOV-billeddannelse inden for en enkelt hjerneregion, MATRIEX-teknikken gav dem data ud over dem, der tilbydes med enkelt-FOV-billeddannelsesteknikker. Taget sammen, disse resultater muliggjorde en meget inhomogen fordeling og transformation af spontane aktivitetsmønstre fra bedøvet tilstand til vågen tilstand hos mus, spænder over et hjernedækkende kredsløbsniveau ved enkeltcelleopløsning.

På denne måde Menge Yang og kolleger udviklede MATRIEX-teknikken baseret på princippet om to-trins forstørrelse og multiakse optisk kobling. De udførte samtidig to-foton Ca ²⁺ billeddannelse i neuronale populationsaktiviteter i forskellige dybder i forskellige regioner (V1, M1 og CA1) i bedøvede og vågne mus med enkeltcellet opløsning. Vigtigere, ethvert konventionelt to-foton mikroskop kan omdannes til et MATRIEX mikroskop, samtidig med at alle originale funktioner bevares. Nøglen til transformation er baseret på designet af en sammensat objektivsamling. Forskerne kan bruge forskellige, omhyggeligt designet MO'er, der passer til forskellige hjerneregioner med 100 procent kompatibilitet mellem MATRIEX-teknikken og konventionel mikroskopi. Forskerholdet forventer, at MATRIEX-teknikken væsentligt fremmer tredimensionel, hjerneomspændende neurale kredsløbsdynamik ved enkeltcellet opløsning.

© 2019 Science X Network