SR-FACT-mikroskopi afslører landskabet i den cellulære organelle interaktom

Fremkomsten af ​​superopløsning (SR) fluorescensmikroskopi har forynget søgen efter nye cellulære understrukturer og dynamiske mellemprodukter. Imidlertid, begrænset af det brede emissionsspektrum af fluoroforer og overdreven fototoksicitet, SR fluorescensmikroskopi kan kun bruges til at fremhæve en håndfuld biomolekyler samtidigt og er ude af stand til at levere et holistisk kort over det cellulære miljø og landskab.

I et nyt papir udgivet i Letvidenskab og applikationer , forskere fra State Key Laboratory for Mesoscopic Physics and Frontiers Science Center for Nano-optoelektronik, Peking Universitet, Kina, Statens centrale laboratorium for membranbiologi, Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, Institut for Molekylær Medicin, Peking Universitet, Kina og kolleger udviklede SR fluorescensassisteret diffraktionstomografi (SR-FACT), som kombinerer etiketfri tredimensionel optisk diffraktionstomografi (ODT) med todimensionel fluorescens Hessian struktureret belysningsmikroskopi. ODT -modulet er i stand til at løse mitokondrier, lipiddråber, kernemembranen, kromosomer, det rørformede endoplasmatiske retikulum og lysosomer. Brug af dual-mode korreleret levende cellebilleddannelse i en længere periode, de observerede nye subcellulære strukturer kaldet mørke-vakuole legemer (DB'er), hvoraf størstedelen stammer fra tætbefolkede perinukleære regioner, og interagerer intensivt med organeller som mitokondrier og kernemembranen, før de i sidste ende kollapser ind i plasmamembranen. Dette arbejde demonstrerer de unikke muligheder ved SR-FACT, hvilket tyder på dens brede anvendelighed i cellebiologi generelt.

SR-FACT visualiserer både mobillandskabet og levende cellers molekylære identitet. En ny algoritme kaldet vektor iterativ søgealgoritme (VISA) blev udviklet for at minimere 3D-billeddannelsesrekonstruktionsfejl under højhastigheds kHz-tomografisk scanningsskema. Som resultat, SR-FACT kan samtidigt udnytte en maksimal billeddannelseshastighed til at fange dynamik i levende celler og opretholde tilstrækkelig fotonflux til maksimal følsomhed. I SR-FACT-systemet, ODT-modulet opnåede en ~ 200 nm lateral opløsning ved en volumetrisk billeddannelseshastighed på 0,8 Hz (40 × 40 × 20 m ³ ). Hessisk 2-D-SIM, som tillader SR -billeddannelse ved en brøkdel af foton -dosis, der bruges af konventionelt SIM, blev brugt til at guide fortolkningen af ​​strukturer observeret af ODT -modulet. Ved at udføre dual-mode korreleret billeddannelse i COS-7-celler, de løste seks kendte organeller uden mærkning:det rørformede endoplasmatiske retikulum (ER), mitokondrier, sene endosomer/lysosomer (LEs/LYs), LD'er, kernemembranen og kromosomer. Alle disse data fremhæver den unikke fordel ved SR-FACT ved undersøgelse af organelle-interaktomet. I øvrigt, de observerede også vakuolerede strukturer med neutral pH, der hovedsagelig indeholdt væske i lumen. Timelang tidsforløbet levende celle SR-billeddannelse i kombination med kvantitativ analyse afslører de ukonventionelle menneskehandelveje og uundværlige roller for vakuoler i organisering af organelle-interaktomet, alt dette tyder på, at de repræsenterer tidligere uvurderede organeller.