Ny teknik øger klarheden af ​​kryo-elektronmikroskopi, sikkerhed

Når forskere havde brug for at visualisere strukturen af ​​piggproteinet, som coronavirus bruger til at infiltrere menneskelige celler, de vendte sig til kryo-elektronmikroskopi. Et af de mest kraftfulde billedværktøjer i en forskers arsenal, cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) kan visualisere proteiner, patogener og forskellige cellekomponenter næsten ned til deres individuelle atomer.

Men at forberede prøver til cryo-EM er en besværlig proces, der er afhængig af ethan-et kraftigt kølevæske i flydende form, og en brandfarlig gas ved stuetemperatur, der er udsat for eksplosioner.

En ny undersøgelse offentliggjort 7. september i International Union of Crystallography Journal viser, at cryo-EM-prøver kan fremstilles med et sikrere og billigere kølevæske-flydende nitrogen-og disse prøver kan producere endnu skarpere billeder end dem, der er fremstillet med ethan. Resultaterne ophæver konventionel visdom, der går tilbage til 1980'erne, og kan forbedre sikkerheden og kvaliteten af ​​cryo-EM.

"Ethan er ikke et standard laboratoriekemikalie. Det er farligt, og brug af det tilføjer yderligere komplikationer, "sagde seniorforfatter Robert Thorne, professor i fysik ved College of Arts and Sciences og en Weiss Presidential Fellow. "Flydende nitrogen er det valgte kølevæske."

Cryo-EM virker ved at affyre elektroner gennem molekyler, der flashfryses i et glasagtigt lag vand, fange flere fuzzy billeder af molekylerne i isen. Sofistikeret software kan ofte gennemsnitlige disse slørede klip til et skarpt 3D -billede, men ikke konsekvent.

Noget af sløret kommer fra selve prøven. Når vandet, der omslutter molekylerne, afkøles for langsomt, det danner iskrystaller, der nedbryder billedet. Forskere omgår dette problem ved at bruge ethan til at afkøle vandet så hurtigt, at det klikker ned i et glasagtigt, krystalfrit ark. Men sådan hurtig nedfrysning lægger stress på arket, som hviler på en tynd film af guld. Når elektronstrålen rammer arket, stress får molekylerne til at bevæge sig, sløring af det sidste billede i et fænomen kendt som stråleinduceret bevægelse.

"Vi har to modsatrettede faktorer, "Thorne sagde." Vi vil afkøle prøverne hurtigt, for at forhindre dannelse af iskrystaller og for at fange molekylernes biologiske struktur. Men vi vil også afkøle prøverne så langsomt som muligt for at minimere deres bevægelse under billeddannelse. "

Ethan køler prøver meget hurtigt. Men forskere skal bruge flydende nitrogen til at omdanne etangas til en væske, og derefter mere flydende nitrogen til opbevaring af prøver, efter at de er frosset. "Ethane er besværligt, det er farligt, og, ultimativt, prøverne ender alligevel i flydende nitrogen, "Sagde Thorne.

Flydende nitrogen afkøler med hastigheder, der er omtrent 50 gange langsommere end ethan, ifølge rapporter i de sidste 40 år, og det er ikke hurtigt nok til at omdanne vand til et glasagtigt ark. Men i 2006, Thornes forskningsgruppe opdagede, at hovedfaktoren, der bremsede nitrogen, var kold gas, der svævede over væskens overflade, som afkølede små prøver, før de nogensinde kom til væsken.

Thornes firma, MiTeGen, til sidst udviklet et automatiseret køleinstrument til røntgenkrystallografi-en anden metode til billedproteinmolekyler-der fjerner den kolde gas lige før en prøve styrtes ned i nitrogen, og fandt ud af, at kølehastighederne steg til kun seks gange langsommere end etan. MiTeGen-personale tilpassede derefter deres køleinstrument til cryo-EM-prøver og samarbejdede med personale ved Cornell Center for Materials Research og postdoc-associeret Jonathan Clinger for at indsamle og analysere cryo-EM-data.

Som den nye undersøgelse rapporterer, nitrogen afkøles med den perfekte hastighed til kryo-EM-prøveforberedelse-hurtigt nok til at undgå betydelig iskrystaldannelse, men langsom nok til at reducere stråleinduceret bevægelse senere.

"Ethane er overkill, "Thorne sagde." For hastighed behøver du ikke, du får slørede billeder med stråleinduceret bevægelse, og det er mere problematisk end nogen iskrystaller, der dannes ved lidt langsommere afkøling. "

Og køling af flydende nitrogen, Thorne sagde, vil forenkle cryo-EM arbejdsgange, fjernelse af de ekstra trin, som etan kræver, og gør det lettere at designe automatiserede køleinstrumenter, der opfylder de nuværende laboratoriesikkerhedsstandarder.

"Dette er en god illustration af, hvordan grundlæggende akademisk videnskab - at undersøge, hvordan små genstande afkøles, og hvordan is dannes inden i dem - kan føre til praktiske løsninger og kommercielle produkter."