Sådan laver du en kalibreringsstandard til en HPLC

Ved arbejde med højtryksvæskekromatografi (HPLC) er god kalibrering absolut nødvendig for at sikre pålidelige, kvalitetsmæssige resultater. Korrekt kalibrering af et HPLC instrument begynder med en passende kalibreringsstandard. I de fleste tilfælde kræver kalibrering i virkeligheden en række standarder for stigende koncentration for at producere det såkaldte kalibreringskurve. Dette er en plottet linje og tilhørende ligning, der beskriver forholdet mellem koncentrationen af ​​det kemikalie, der testes for og responsen fra HPLC detektoren.

Bestem det kemikalie, som du vil teste for at bruge HPLC (" analyt "). For eksempel kan du ønske at teste en række læskedrikke til fructoseindhold, i hvilket tilfælde fructose ville være analyten.

Hent en mængde af analytkemikalien af ​​passende renhed. Normalt bør renheden være over 99%, og analytten skal købes hos et velrenommeret kemisk forsyningsfirma. I tilfælde af fructose vil du for eksempel købe ren fructose fra en kemisk leverandør og ikke fra en købmand.

Bestem analytens maksimale og minimale forventede koncentrationer i de prøver, du har til hensigt at teste på HPLC. I tilfælde af læskedrikke vil du undersøge etiketterne for drikkevarer og bestemme det laveste og højeste fructoseindhold blandt de drikkevarer, du vil teste. Husk, at den indledende prøve (sodavand) kan fortyndes eller manipuleres på anden måde under forberedelse til analyse (afhængigt af den anvendte HPLC-metode), og således kan analytkoncentrationen i de prøver, der faktisk injiceres på HPLC, modificeres. Det er analytkoncentrationen i prøverne som køre på den HPLC, der skal overvejes.

Bestem opløsningsmidlet, hvor du vil opløse din analyt for at lave kalibreringsstandarder. Dette opløsningsmiddel skal være i stand til korrekt opløsning af analytten over en relativt bred koncentration (mindst lige så høj som i de prøver, du har til hensigt at teste). Desuden bør dette opløsningsmiddel ideelt set svare til den "mobile fase:" opløsningsmidlet bruges til at bære prøver gennem HPLC-instrumentet.

Beregn mængden af ​​analyt, der kræves for at lave en "stock standard" -opløsning af analyt. Dette findes ved at multiplicere den krævede koncentration af lagerstandarden med det ønskede volumen. Koncentrationen af ​​analytten i denne opløsning skal være mindst 10% højere end den højeste forventede prøvekoncentration. Hvis den højest forventede fructosekoncentration i en læskedamp er 8 gram /100 ml, så kan lagerstandarden gøres til en koncentration på 10 gram fructose /100 ml. En rimelig mængde er 500 milliliter, således 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fructose ville være påkrævet.

Afvej den nødvendige mængde analyt til et passende niveau af præcision. Ofte er en vægtværdi i gram præcis til en eller to decimaler egnet, men mere præcision kan være nødvendigt for nogle metoder.

Overfør den vejede analyt til en volumenkolbe med det nødvendige volumen og tilsæt det ønskede opløsningsmiddel til Fyld mærket på kolben. Anvendelse af en volumetrisk kolbe (i stedet for et gradueret bæger, for eksempel) øger præcisionen af ​​bestandens standardkoncentrationsværdi. Sørg for, at all analyt er overført til kolben; Brug noget af opløsningsmidlet til at vaske det om nødvendigt.

Stopper den målekolbe og skub forsigtigt eller omvendt, indtil analysen er helt opløst.

Lav en række forskellige fortyndinger af lageret standard ved at overføre kendte mængder af lagerstandarden til volumetriske kolber, ved hjælp af pipetter til nøjagtig overførsel, og derefter tilsætte opløsningsmiddel. Den laveste standardkoncentration bør være under den laveste forventede prøve, som skal analyseres. I eksempelvis sodavand, hvis den laveste forventede fructosekoncentration i en prøve er 2 gram /100 ml, kan der laves en 1 gram /100 ml standard. Dette ville ske ved en tifoldig fortynding af lagerstandarden. Standardserien skal indeholde i alt 5 eller 6 koncentrationer, så yderligere fortyndinger til fremstilling af standarder på måske 3, 5 og 8 gram fructose /ml ville være påkrævet. Du har nu en række standardløsninger til at kalibrere HPLC.

Tip

Det er muligt at lave kalibreringsstandarder, der indeholder mere end en analyt, hvis det kræves. Det er ofte god praksis at filtrere kalibreringsprøver (og standarder), før de injiceres på HPLC for at fjerne eventuelle fine partikler, som kan tilslutte instrumentet.

Advarsel

Nogle standarder nedbrydes hurtigt, når de er lavet. Sørg for, at dine standarder udskiftes ofte, hvis dette er tilfældet. Som ved alle kemiske procedurer skal du overholde de korrekte forholdsregler, når du arbejder med potentielt skadelige analytter eller opløsningsmidler som dem, der er giftige eller brændbare.