Rød fluorescens i to trin

Forskere har identificeret den mekanisme, der tillader fluorescerende proteiner at skifte farve i to faser. De lægger dermed grunden til nye anvendelser inden for mikroskopi og funktionsanalyser i biologisk forskning.

Det hele startede med en observation, som ETH-forskere lavede for omkring to år siden med et specielt fluorescerende protein isoleret fra koraller, Dendra 2, som fluorescerer grønt. Lys kan bruges til at ændre dets molekylære struktur, så det skifter farve til rødt. Forskerne opdagede en ny måde at inducere denne farveskift på:For det første, den exciteres kortvarigt med en puls af blåt laserlys og belyses derefter straks med nær-infrarødt lys. Anvendelser for denne tofasede farveafbryder omfatter fluorescensmikroskopi.

Et internationalt team af forskere ledet af Periklis Pantazis, ved Institut for Biosystemvidenskab og Teknik (D-BSSE) ved ETH Zürich i Basel, har nu forklaret denne to-fasede farveafbrydermekanisme. Forskerne omtaler dette som "forberedt konvertering". Den nye viden giver forskerne mulighed for at modificere andre lysfølsomme proteiner, så de også kan exciteres i to faser.

Forskerne fra ETH Zürich, Karlsruhe Institute of Technology, og Janelia Research Campus i Ashburn, Virginia, nøje undersøgt proteinerne aktiveret med blåt lys og lykkedes med at vise, at disse proteiner går ind i en exciteret tilstand, der varer flere millisekunder. "Det er relativt langt, " forklarer Pantazis. "Andre fluorescensfænomener er meget kortere."

Forskerne demonstrerede også, at denne tilstand er et tilfælde af et fænomen kendt fra kvantekemien - en "triplettilstand". Efter cirka fem millisekunder, det fluorescerende protein Dendra 2 vender tilbage til sin grundtilstand. Primet konvertering sker kun, hvis den anden fase - belysning med nær-infrarødt lys - sker inden for triplettidsvinduet.

Modificerede aminosyresekvenser

Varigheden af ​​triplettilstanden afhænger i høj grad af stabiliteten af ​​det fluorescerende protein. Det her, på tur, afhænger af den nøjagtige rækkefølge af proteinbyggesten (aminosyrer), hvilket er grunden til, at forskerne modificerede Dendra 2-aminosyresekvensen flere steder. Derefter, de gjorde det samme med et andet fluorescerende protein, Eos. Indtil nu, dette protein kunne ikke exciteres i to faser. Det er dokumenteret i den videnskabelige litteratur, at disse steder er afgørende for triplettilstanden.

Forskerne målte varigheden af ​​triplettilstanden med alle de nye proteiner. Denne tilstand blev betydeligt forlænget i flere af de testede proteiner. Forskerne var også i stand til at modificere Eos-proteinet, så det også kunne aktiveres i to faser. Det lykkedes dem at gøre dette med yderligere seks proteiner, der aldrig var blevet aktiveret i to faser før. "De modificerede proteiner blev ikke bare gjort omskiftelige i to faser for første gang, de er også mere stabile og fluorescerer derfor mere intenst, siger Manuel Mohr, en ph.d.-studerende i Pantazis' gruppe og hovedforfatter af undersøgelsen.

Forskerne gjorde den oprindelige opdagelse med en laser, der ikke er konventionelt tilgængelig, som bruger lys i det nær-infrarøde område. I dag, imidlertid, forskerne har vist, at effekten også kan opnås ved hjælp af de samme konventionelle røde lasere, som findes i hvert fluorescensmikroskop. Med andre ord, primet konvertering er mulig med ethvert fluorescensmikroskop.

Grundet konvertering kan bruges i mikroskopi for at markere et snævert defineret punkt i en vævsprøve. Det gør forskerne ved at rette en blå og rød laserstråle ind i vævet, så strålerne krydser hinanden i et enkelt punkt. Grundet konvertering finder kun sted i dette kryds. "Fordi hverken blåt eller rødt laserlys har en giftig effekt, metoden er ideel til levende organismer, " siger Pantazis. Anvendelser med andre mikroskopiteknikker kan også være mulige, inklusive superopløsningsmikroskopi, som har eksisteret i flere år nu.

Hjernekortlægning og gensekventering

"Vi ved nu, hvordan man modificerer fotokonverterbare proteiner for at få dem til at skifte i to faser, " says Pantazis. The ETH scientists are working together with protein experts to modify other fluorescent proteins used in microscopy in the same way.

The researchers recently modified proteins so that they can be split off from a gene-activating messenger in a way that allows them to be light-activated with two colours. For eksempel, they could illuminate tissue with a blue and red beam intersecting at a single point, making it possible to activate specific genes in a single cell of the tissue. Proteins that detect calcium can be modified in this way, såvel, and could potentially be used for 3-D brain mapping.

Biologists can ultimately use the new technique for other functional analyses in 3-D. ETH Zurich has already issued several licences for the patent, including to a start-up that plans to develop a DNA sequencing technique using a 3-D matrix.