Ny metodologi øger opløsningen i oligodendrocytproteomik

En af proteomikkens vigtigste udfordringer, undersøgelse af alle proteiner udtrykt af en celle eller organisme, skelner mellem molekyler, der er strukturelt forskellige, men alligevel har samme masse. Dette er svært, fordi et massespektrometer, det vigtigste apparat, der anvendes i denne type undersøgelse, fungerer som en vægt, sortering af de analyserede molekyler efter deres masse.

En måde at reducere forvirring på, når du bruger et massespektrometer, er at starte med at underkaste prøven væskekromatografi, som adskiller hydrofile ("vandelskende") proteiner fra hydrofobe. De hydrofile proteiner kommer først ind i spektrometeret, og de mest hydrofobe er tilbage til det sidste, mindske sandsynligheden for, at to forskellige molekyler med ækvivalente masser vil blive fortolket som kun ét af apparatet.

"Det er som at løse et puslespil med millioner af brikker. Når du først åbner posen, brikkerne er alle rodede og overlappende. Du skal begynde med at sortere dem fra. Når vi arbejder med proteomics, vi bestræber os konstant på at udvikle mere raffinerede sorteringsteknikker, " sagde Daniel Martins-de-Souza, som leder Neuroproteomics Laboratory ved University of Campinas (UNICAMP) i Brasilien.

I en undersøgelse med resultater for nylig offentliggjort i Proteomik , Martins-de-Souzas gruppe optimerede en metode til at øge opløsningen af ​​proteomisk analyse ved massespektrometri. Takket være en kombination af to andre teknikker - todimensionel væskekromatografi og ionmobilitet - lykkedes det for gruppen at identificere 10, 390 proteiner udtrykt i oligodendrocytter, centralnervesystemets celler, der er ansvarlige for at producere myelin, et lipidstof, der spiller en væsentlig rolle i informationsudvekslingen mellem neuroner.

Med FAPESP's støtte, UNICAMP-gruppen har studeret det humane oligodendrocyt-proteom i flere år, med det formål bedre at forstå årsagerne til skizofreni som grundlag for at foreslå nye terapeutiske tilgange. "Vi har nu en langt mere komplet oligodendrocytproteindatabase, som vil være nyttige for vores egne og andre forskeres undersøgelser på området, " sagde Martins-de-Souza. "Det er tilgængeligt online, og data kan downloades. Ud over, optimeringsteknikken kan bruges til at studere proteomet af enhver biologisk prøve."

I en tidligere undersøgelse, der brugte enkeltdimensionel væskekromatografi til forsortering, gruppen havde kun identificeret 2, 290 proteiner i oligodendrocytter.

Ifølge Martins-de-Souza, i øjeblikket tilgængelige behandlinger for skizofreni fokuserer på neuroner, men de neurale kommunikationsfejl observeret hos patienter kan skyldes oligodendrocytdysfunktion. "En af vores forskningslinjer består i at evaluere, hvordan de lægemidler, der bruges til at kontrollere skizofreni, modificerer oligodendrocytproteomet, " sagde han. "Med denne nye metode, vi kan få fem gange mere information om disse stoffers rolle."

Undersøgelsen blev udført under den postdoktorale forskning af Juliana Silva Cassoli og masterforskningen af ​​Caroline Brandão Teles, både med stipendier fra FAPESP og supervision af Martins-de-Souza. Det første trin i proteomisk analyse ved hjælp af massespektrometri er at nedbryde proteinerne ekstraheret fra den biologiske prøve af interesse, som i dette tilfælde består af oligodendrocytter, til mindre partikler kaldet peptider.

"Et lille protein kan give anledning til mindst 10 forskellige peptider. Spektrometret er ikke godt til at analysere hele molekylet på grund af dets store størrelse, Martins-de-Souza forklarede.

Næste, gruppen underkastede prøven adskillelse ved kromatografi. I stedet for at bruge en enkelt matrix, som i den konventionelle teknik, de brugte to. I den første adskillelse, kun en femtedel af de injicerede peptider kom ind i spektrometeret i flydende form. Dette blev efterfulgt af endnu en femtedel i den anden separation, og så videre.

"Det er, som om du spreder puslespillets brikker ud med begge hænder i stedet for kun én, " sagde Martins-de-Souza.

Inde i spektrometeret, prøven omdannes til gas og flyver frem og tilbage i et vakuum. Jo mindre peptid, jo hurtigere den når sin destination, og apparatet måler så sin masse.

Mens molekylerne flyver rundt inde i spektrometeret, ionmobilitetsteknikken sprøjter en lille mængde gas ind i apparatet gennem et rør.

"Den modstand, som molekylet tilbyder gassen, afhænger af dets tredimensionelle form, så hvis to forskellige peptider med samme masse flyver sammen, og vi injicerer gassen i den modsatte retning, de vil have tendens til at blive adskilt af modstandskraften mod gassen. Det er som at tage to ark papir op med samme masse, at krølle en til en kugle, og droppe dem begge. På grund af sin form, det krøllede lagen når gulvet først, Martins-de-Souza forklarede.

I slutningen af ​​eksperimentet, de mere end 223, 000 peptider identificeret af spektrometeret blev rekonstrueret ved hjælp af bioinformatiske værktøjer, resulterede i de 10, 390 proteiner beskrevet i papiret. Gruppen brugte også bioinformatik til at kortlægge de cellulære rum, hvori proteinerne er placeret, og de biologiske processer, de er involveret i.

"Ideelt set det bør være muligt at identificere mindst to peptider pr. protein. Den vej, we can be sure a molecule is really present in the sample, since two proteins with two exactly identical peptides are unlikely to occur. I dette studie, about 20% of the proteins were identified by more than 20 peptides, " Martins-de-Souza said.

The methodology enabled the researchers to identify even proteins that were relatively scarce in the sample, dvs. in quantities some 10 million times smaller than those of the most highly expressed molecules.

"One of the problems with mass spectrometry is that a very large piece of the jigsaw puzzle may hide several smaller ones. However, with an effective tool to spread out the pieces, you can see practically all of them, " Martins-de-Souza said.