En superopløsningsvisning af kemiske reaktioner

Forskere fra Institut for Fysisk Kemi ved det polske Videnskabsakademi har demonstreret, ved hjælp af en mikroskopisk superopløsningsteknik, hvordan man følger kemiske reaktioner, der finder sted i meget små mængder. Metoden er udviklet i samarbejde med PicoQuant GmbH, og gør det muligt at observere reaktioner i individuelle cellulære organeller såsom cellekerner.

De kemiske mekanismer, der er ansvarlige for cellens vitale funktioner, skjuler stadig mange hemmeligheder - først for nylig har forskere haft værktøjerne til at se direkte på de kemiske fænomener, der opstår i levende celler. Imidlertid, på grund af fortsatte tekniske begrænsninger, videnskaben mangler grundlæggende viden om ligevægtskonstante værdier af kemiske reaktioner i celler. Med andre ord, forskere ved stadig ikke, hvor meget af et kemikalie, der er involveret i en given cellulær reaktion, er i en allerede reageret form, og hvor meget der er i en ikke-reageret form. Disse udfordringer er blevet overvundet i denne undersøgelse. Forskningssamarbejdet har udviklet og demonstreret en modifikation af superopløsningsfluorescenskorrelationsspektroskopi.

"Vi har beskæftiget os med kemiske reaktioner i celler i lang tid. F.eks. i 2013, vi bestemte diffusionskoefficienterne for alle proteinerne i Escherichia coli bakterien, takket være det blev det muligt at bestemme hastigheden af ​​reaktioner, der fandt sted med deres deltagelse. Her var vi interesserede i et lignende problem i situationer, der involverede lave koncentrationer af reagenser, " siger prof. Robert Holyst (IPC PAS). "Biologiske reaktioner er generelt reversible og, hvor de forekommer, der skabes normalt en vis dynamisk ligevægt mellem mængden af ​​reagerede og uomsatte stoffer. I vores forsøg på at bestemme ligevægtskonstanterne for forskellige reaktioner i celler, vi kiggede på super-opløsning fluorescenskorrelationsspektroskopi. Og her, vi stødte på et interessant teknisk problem, hvis løsning åbnede nye muligheder for os i studiet af livets kemi."

Der er mange varianter af mikroskopi, inklusive dem, der visualiserer individuelle atomer. Imidlertid, når man observerer celler, optisk mikroskopi forbliver uovertruffen på grund af dens lave invasivitet og evnen til at visualisere den rumlige struktur af levende organismer. I lang tid, dens grundlæggende ulempe var dens relativt dårlige opløsning - grundlæggende fysiske begrænsninger (diffraktion) gør det umuligt at skelne detaljer mindre end omkring 200 nanometer ved standard optiske teknikker.

En type optisk mikroskopi er fluorescensmikroskopi. Det involverer at indføre et fluorescerende farvestof på stederne for den biologiske prøve, der undersøges, og derefter scanne prøven med en fokuseret laserstråle, som stimulerer farvestofmolekylerne til at gløde. I 1994, Stefan W. Hell præsenterede en metode til at overskride diffraktionsgrænsen i fluorescensmikroskopi ved hjælp af stimuleret emissionsdepletering (STED). STED kræver en ekstra laserstråle, der ligner en donut i tværsnit. Denne stråle slukker de ydre områder af laserstrålens hovedfokus og reducerer følgelig dens størrelse til værdier under diffraktionsgrænsen. Med superopløsningsmetoder er det nu muligt at se rumlige detaljer på kun 10 nm med en tidsopløsning på op til mikrosekunder.

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) er en ny gren af ​​optisk mikroskopi til undersøgelse af molekylers bevægelse. I superopløsningsvarianter, laserens fokus har et volumen målt i snesevis af attoliter (en attoliter er en milliardtedel af en milliardtedel af en liter). Målingen involverer måling af lyset, der udsendes af et fluorescerende farvestof, der er fastgjort til det testede molekyle exciteret af en laserstråle. At kende størrelsen af ​​fokus og varigheden af ​​fluorescens, og med hjælp fra de relevante teoretiske modeller, det er muligt at bestemme hastigheden af ​​selv individuelle molekyler.

"I nogen tid, det har været kendt, at mens superopløsnings-FCS-mikroskopi fungerer godt, når man observerer molekyler, der bevæger sig i to dimensioner, f.eks. i lipidmembraner, det fejler i observationer i mængder. Diffusionstider, bestemt på grundlag af målinger i 3-D, kunne afvige fra forudsigelserne fra målinger i 2-D med en størrelsesorden eller endnu mere. Efter et par måneders research, det blev klart for os, at disse uoverensstemmelser skyldtes den alt for forenklede måde at bestemme fokusets rumlige størrelse på, " siger Dr. Krzysztof Sozanski (IPC PAS).

På baggrund af deres egne teoretiske analyser og erfaringer, Warszawa-forskerne konstruerede en ny, universel teoretisk model, der introducerer en korrektion af fokusets rumlige form og tager hensyn til dets indvirkning på det målte signal-til-støj-forhold. Modellens rigtighed blev oprindeligt verificeret i målinger af diffusionshastigheden af ​​forskellige fluorescerende prober i opløsninger.

"Vi udførte også mere avancerede forsøg. F.eks. vi studerede en reversibel reaktion, hvor farvestofmolekylerne fæstnede sig til miceller og derefter løsnede sig efter nogen tid. Systemet, sammensat af relativt store kugler af overfladeaktive molekyler, der reagerer med farvestofmolekylerne, reflekterede forhold, der er karakteristiske for biologiske strukturer, " siger Ph.D.-studerende Xuzhu Zhang (IPC PAS). Målingerne var ikke enkle. Hvis molekylerne i begge reaktanter bevægede sig langsomt, når det passerer gennem fokus, kunne farvestoffet gentagne gange smelte sammen/frakobles med/fra micellerne, og gennemsnittet af det udsendte lys ville blive beregnet.

Men der kunne også være en variant af den anden yderlighed:Tilslutnings- og afbrydelsesreaktionerne kunne løbe så langsomt, at der under overgangen gennem fokus ikke ville være nogen ændring i forholdet mellem reagenserne – så ville der ikke være nogen gennemsnit. "Vores model tager ikke kun hensyn til begge ekstreme tilfælde, men også alle de mellemliggende. Og med den viden, vi har til rådighed om den faktiske størrelse af fokus, vi er i stand til at ændre dens størrelse og eksperimentelt undersøge alle de tilfælde, som modellen kræver både i det samme kemiske system og på det samme udstyr, " understreger Zhang.

Et vigtigt træk ved den analysemetode, der er udviklet på IPC PAS, er det faktum, at der ikke er behov for ændringer i apparatur til dens anvendelse. Efter passende tilpasning, metoden kan bruges til mere præcist at fortolke data optaget af FCS-klare STED-mikroskoper, der allerede er i produktion.