Hvordan skiftende laboratorier afslørede en kemisk reaktionsnøgle til kataraktdannelse

Forskere, der arbejder på at forstå biokemien i dannelsen af ​​grå stær, har gjort et overraskende fund:Et protein, der længe blev antaget at være inert, har faktisk en vigtig kemisk funktion, der beskytter øjets linse mod dannelse af grå stær.

Linsen består af celler pakket med strukturelle proteiner kaldet krystalliner. Krystalliner i hver linsecelle danner en proteintæt gel, og gelens optiske egenskaber – som dens gennemsigtighed og måden den bryder lys på – hjælper med at fokusere lyset på nethinden.

Men når krystallinske proteiner klumper sig sammen, de er ikke længere så gennemsigtige. Hvis nok af proteinerne går fra deres sædvanlige vandopløselige, tætpakket organisation til klumpete aggregater, de begynder at sprede indkommende lys, danner uklare aflejringer kendt som grå stær.

Ifølge Harvard postdoc Eugene Serebryany, hovedforfatter på en nylig undersøgelse i Journal of Biological Chemistry , i lang tid troede forskere, at krystallinske proteiner var kemisk inerte. Det er, bortset fra aggregering som en individuel aldre, proteinerne blev ikke antaget at interagere meget med andre proteiner. Serebryany sagde, "Dette var modellen:(crystallins) reelle funktion er at forblive monomer og gennemsigtig og undgå at aggregere så længe som muligt."

Dengang han var kandidatstuderende ved MIT, Serebryany brugte en mutant form af linseproteinet gamma-crystallin til at efterligne UV-skade på proteinet. Mens man studerer, hvordan den mutation får krystallin til at aggregere til klumper, Serebryany fandt noget overraskende:Mutanten var mere tilbøjelig til at aggregere hvis vildtype, eller ubeskadiget, protein var også til stede.

Harvard professor Eugene Shakhnovich, som samarbejdede med Serebryany og hans kandidatrådgiver, Jonathan King, på tidligere undersøgelser, beskrev fundet som "et ret slående fænomen" og forklarede:"Hvis du havde disse beskadigede proteiner i et reagensglas, de ville ikke samle sig i et stykke tid. Hvis du havde vildtypeproteinet, det ville ikke samle sig for evigt. Men derefter, når du blander de to, du ser hurtig og brat aggregering."

Med andre ord, den sunde version af et protein, som alle havde troet var inert, fik på en eller anden måde en let beskadiget version til at blive meget værre - og hurtigt.

Da Serebryany dimitterede, Shakhnovich hyrede ham til at fortsætte arbejdet for at forstå, hvordan et angiveligt inaktivt protein kunne forårsage denne effekt. Serebryany sagde, "Det første, jeg skulle gøre, var dybest set at prøve at få eksperimenterne fra mit ph.d.-laboratorium til at fungere i dette (nye) laboratorium."

"De er kun to stop fra hinanden i metroen!" Shakhnovich jokede.

Men, af en eller anden grund, Serebryany havde problemer med at kopiere resultaterne. "Det er et andet sted, det er et andet sæt instrumenter, et lidt anderledes sæt procedurer. Du kan se, hvor det går hen, sagde han. Pludselig, eksperimenter, der var meget reproducerbare før, gav en masse variation."

Ja, i Harvard-laboratoriet fik vildtype-krystallin nogle gange mutantkrystallin til at aggregere, og nogle gange gjorde det ikke. Forskerne var mystificerede.

Serebryany sagde, "Naturligvis, hvis der pludselig er variation, der er en skjult variabel, som vi ikke har set før." Han oprettede en række eksperimenter, der forsøgte at lokalisere denne variabel.

En tæt sammenligning af molekylvægtene af vildtype-proteinet, der fik mutanten til at klumpe, og proteinet, der ikke afslørede en forskel svarende til vægten af ​​to hydrogenatomer. Dette gav forskerne et hint om, at redoxtilstanden - om to svovlatomer i et proteinmolekyle var bundet til hinanden i stedet for til brintatomer - kunne gøre en forskel.

"Ved at udføre isotopisk opløste massespektrometrieksperimenter, vi fik mere, end vi havde regnet med, Serebryany forklarede. "Ikke kun erhvervede den aggregeringstilbøjelige mutant en intern disulfidbinding pr. molekyle under aggregeringsreaktionen, men det aggregeringsfremmende vildtypeprotein mistede samtidig sit disulfid."

Ved at mutere de svovlholdige cysteinaminosyrerester en efter en til ikke-svovlholdige rester, Serebryany fandt ud af, at to cystein-aminosyrer tæt sammen på overfladen af ​​gamma-d-crystallin fungerede som en slags switch. Da de to bandt, at lave en struktur kaldet en disulfidbinding, krystallin syntes at være i stand til at skubbe beskadigede medmolekyler mod aggregering. Når de to cysteiner ikke var bundet, hver tog i stedet et brintatom, forklarer proteinets lille ændring i masse. Under den betingelse, vildtype-krystallin var inert.

Men hvordan kunne en binding mellem aminosyrer på overfladen af ​​dette protein få det til at drive andre proteiner til at aggregere?

Brug af biofysiske og biokemiske teknikker, holdet fandt ud af, at selvom disulfidbindingen let dannes, det introducerer også stamme i proteinets struktur. Dette gjorde, at hvert proteinmolekyle sandsynligvis passerede langs disulfidbindingen til et nærliggende molekyle af proteinet, modtager to protoner til gengæld. På denne måde kunne disulfidbindingen konstant føres rundt mellem krystallinske proteinmolekyler. Forfatterne sammenlignede processen med at sende en varm kartoffel.

Givet en hel befolkning af sunde, ubeskadigede krystallinske proteiner, denne proces kan fortsætte i det uendelige. Men hvis et protein allerede var lidt beskadiget, forfatterne viste, den fangede den varme kartoffel med et andet sæt cysteiner, som var mindre i stand til at give det videre. Dette fik det beskadigede protein til at klumpe sig sammen. Forfatternes tidligere arbejde afslørede, at mutationer, der efterligner skader forårsaget af UV, ændrede stabiliteten af ​​proteinet, gør det mere diskret, og derfor mere tilbøjelige til at erhverve den konformation, der afslører nye cysteiner, der kunne fange den varme kartoffel.

Dette hjælper os med at forstå dannelsen af ​​grå stær. Ifølge Shakhnovich, holdet arbejder på peptidbehandlinger, der kan forhindre den "varme kartoffel" i at nå beskadigede proteiner. Serebryany håber, at sådanne peptider "faktisk kunne opsuge nogle af disse disulfider og forsinke den tid, det tager at danne de mere aggregeringstilbøjelige arter." Det kan føre til langsommere kataraktdannelse for patienter.