Osteoblastisk lysosom spiller en central rolle i mineralisering

Mineralisering medieres af osteoblaster, som udskiller mineralprækursorer gennem matrixvesikler (MV'er) som en fundamental proces hos hvirveldyr. Vesiklerne er rige på calcium og fosfat, indeholdende organiske materialer, såsom sure proteiner. I en ny undersøgelse, der nu er offentliggjort i Videnskabens fremskridt , Tomoaki Iwayama og kolleger ved paradentologiske afdelinger, biomedicinsk forskning, mundtlig videnskab, biomaterialer og oral anatomi udvikling brugte scanning elektron-assisteret dielektrisk mikroskopi (SE-ADM) og super-opløsningsmikroskopi (SRM) til at vurdere levende osteoblaster under betingelser med mineralisering på nano-niveau opløsning. De fandt, at de calciumholdige vesikler var multi-vesikulære legemer, der indeholdt mineraliserende nanovesikler eller matrix-vesikler (MV'er). Ifølge observationerne MV'erne kunne transporteres sammen med lysosomer og udskilles ved exocytose. Iwayama et al. fremlagt bevis for, at lysosomerne kunne transportere amorft calciumphosphat i mineraliserende osteoblastceller.

Under den fysiologiske proces med knoglemineralisering, aflejringen af ​​calciumphosphatkrystaller sker i den ekstracellulære matrix som en fundamental proces hos alle hvirveldyr. I 1967, biologerne Clarke Anderson og Ermanno Bonucci, individuelt visualiserede mineral-relaterede partikler i det ekstracellulære rum ved hjælp af elektronmikroskopi (EM). Forskere anerkendte senere disse partikler som mineraliserende nano-vesikler eller matrix-vesikler (MV'er). I løbet af de sidste 50 års EM-undersøgelser af MV'er, biologer har kæmpet for at forstå mekanismen for MV-dannelse og sekretion, som forbliver stort set ukendt.

At afklare mineraliseringsprocessen for levende celler med EM er udfordrende, da prøveforberedelse til EM kræver trin på både kemisk fiksering og alkoholisk dehydrering. Trinnene kan fremkalde artefakter og endda opløse eller fjerne ustabile mineralforstadier, der efterlader et organisk stillads kendt som et "krystalspøgelse". Mens videnskabsmænd med succes havde brugt processen med EM ved at bruge fikseret og dehydreret væv til at se strukturen af ​​mineraliserede kollagenfibriller i knogler, at studere mineralprækursorer, de skal anvende cryo-EM-processer for at undgå dehydrering og lette dyre, ekstrem hurtig afkøling med små prøver.

For at overvinde disse begrænsninger i dette arbejde, Iwayama et al. brugt et nyt mikroskopisk system kendt som scanning elektron-assisteret dielektrisk mikroskopi (SE-ADM). Metoden havde tidligere opnået nanoskala opløsning og høj kontrast billeddannelse for pattedyrceller i vandige medier uden farvning. Forskerne brugte den samme teknik (høj opløsning SE-ADM) til at udforske muligheden for at se MV'er i intakte osteoblaster for at forstå biogenese af MV-handel. Til osteoblastcellelinjen brugte de murin (mus) osteoblastcellelinje KUSA-A1, med høj osteogen kapacitet in vitro og in vivo. Efter cellekultur under passende forhold, Iwayama et al. observerede cellerne med SE-ADM for at identificere normale intracellulære strukturer. Forskerne observerede MV'er for at tilpasse sig kollagenfibriller efter 4 til 10 dages cellevækst i osteogene medier, og den udskilte partikelstørrelse steg på grund af fusion eller partikelvækst, med deres størrelser i overensstemmelse med tidligere rapporter, hvilket tyder på, at de faktisk var MV'er.

Ved yderligere undersøgelse hos SE-ADM, de bemærkede involveringen af ​​den lysosomale vej til at transportere og udskille intraluminale MV'er i en lignende proces som exosomer. Interessant nok, både exosomer og MV'er er kategoriseret som ekstracellulære vesikler med lignende størrelser; de udskilles begge af osteoblaster og har fælles funktioner under celle-celle-kommunikation.

I næste trin, Iwayama et al. undersøgt, om disse partikler var MV'er indeholdende calcium og/eller phosphat. For det, de dyrkede cellerne i osteogene medier i 7 dage og observerede dem ved hjælp af SE-ADM til at registrere meget glatte strukturer uden krystalfacetter. Dette antydede, at MV'erne ikke krystalliserede, men forblev amorfe som også registreret i en tidligere undersøgelse. Da forskerne undersøgte MV'erne på en SiN-film (siliciummononitrid), de observerede skarpe toppe svarende til fosfor, kalk, kulstof- og iltelementer. De bekræftede fundene ved hjælp af Raman -spektroskopi for at vise tilstedeværelsen af ​​calciumphosphat i MV'er.

Forskerne undersøgte også virkningerne af hypofosfatasi, en medicinsk tilstand kodet af Alpl (alkalisk fosfatase) gen , hvor osteoblaster ikke undergår mineralisering in vitro. For det, de redigerede genomet af osteoblastceller ved hjælp af CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologien til at generere Alpl knockout osteoblastkloner. Da Iwayama et al. undersøgte knockout-klonerne ved hjælp af højopløsnings SE-ADM, de observerede ikke MV'er, hvilket blev bekræftet yderligere ved hjælp af spektrometrisk analyse på grund af fraværet af fosfor- og calciumtoppe.

Efter direkte at have observeret produktionen og udskillelsen af ​​MV'er ved hjælp af SE-ADM, forskerne undersøgte yderligere lysosomers involvering i intracellulær handel med MV'er for at observere levende osteoblastmineralisering. De dyrkede cellerne i calciumholdige osteogene medier og farvede dem med LysoTracker for at detektere de intercellulære komponenter af interesse. Iwayama et al. lokaliseret de calcein-opfyldte vesikler matchet med lysosomer for at antyde biogenesen af ​​MV'er i lysosomer efter deres fusion med calcein ⁺ vesikler. Forskerne fulgte eksperimenterne med undersøgelser med tab af funktion og funktionel hæmning for yderligere at dekonstruere veje og undersøge intracellulære virkningsmekanismer under mineralisering af levende celler in vitro.

Scientists had previously reported the involvement of mitochondria during mineralization due to the presence of electron-dense calcium and phosphorous-rich granules in osteoblast mitochondria. This was observed with a modified cryotechnique. Desuden, reports also suggest the direct contact of lysosomes and mitochondria with functional significance. When Iwayama et al. stained cells with LysoTracker together with MitoTracker and observed the intracellular components under N-SIM structured illumination super-resolution microscopy (SRM). They observed the presence of most calcein-fulfilled vesicles next to mitochondria and matched with lysosomes. During SRM-time lapse imaging, the scientists further obtained views of intracellular transport of LysoTracker containing vesicles fused to static calcein vacuoles adjacent to mitochondria to validate their hypothesis.

På denne måde together with observations of other SRM systems and additional cell lines, Tomoaki Iwayama and colleagues proposed a mineralization mechanism. Wherein lysosomes played a central role in intracellular MV biogenesis and trafficking within osteoblasts. It was reasonable to involve lysosomes for osteoblasts to transport amorphous calcium phosphate without crystallization during its transport in the cytosol. The scientists aim to conduct further experiments to understand the regulatory molecules for MVs and investigate if MVs and exosomes have similar constitutions and mechanism underlying their generation, secretion and function. The SE-ADM strategy used in the present work can be installed into existing scanning electron microscopy apparatus at a low cost. The work developed in the study will offer non-invasive, high-resolution imaging at the nanoscale applicable to all scientific fields.

© 2019 Science X Network