Mikrofluidik:2-D fingeraftryk af heterogene proteiner i opløsning

Mikrofluidiske systemer bruges i molekylærbiologi, biokemi og bioteknologi til hurtigt at analysere heterogene biomolekylære blandinger med høje genvindingshastigheder og små prøvevolumener. Imidlertid, det er udfordrende at kombinere forberedende og analytiske processer inden for en enkelt enhed til hurtig integreret analyse. I en nylig undersøgelse offentliggjort på Mikrosystemer og nanoteknik , Kadi L. Saar og medarbejdere ved de tværfaglige afdelinger for kemi, fysik, og Fluidic Analytics Limited i Cambridge, U.K., har udviklet en chip, der kombinerer de to trin forberedelse og analyse.

I første omgang, de brugte spænding til at adskille proteinmolekyler i en binær blanding af lige store biomolekyler, der ikke kunne skelnes via konventionel størrelses- eller opløsningsteknikker. Derefter, forskerholdet brugte den nye enhed til at opnå et 2-D fingeraftryk af en heterogen proteinblanding. Resultaterne vil åbne nye muligheder for at erhverve hurtige multiparameterdata om biomolekylære systemer på en kort tidsskala.

Mikrofluidiske teknikker er attraktive at analysere biologiske prøver på grund af meget lave prøvekrav og en høj genvindingshastighed. Platformene kan give uovertruffen analysehastighed på niveauet af individuelle driftsenheder eller give flere enheder direkte kombineret arbejdsgang, uden prøveoverførsel mellem enhederne. Sådanne overførsler sker gennem konnektorer eller rør og introducerer dispersion til prøven, påvirker systemets ydeevne. Den heri foreslåede arbejdsgang kan adskille heterogene blandinger for at bestemme komponenterne af interesse og reducere kompleksiteten til yderligere behandling af blandingen til dens oprensning.

Forskere havde tidligere introduceret en række kontinuerlige flow-baserede molekylære separationsstrategier på mikron skala, inklusive fristrømselektroforese, dielektroforese, magnetoforese og akustoforetisk adskillelse. Detektionsstrategier såsom laser- eller LED-induceret fluorescens (LIF), kemiluminescens eller elektrokemiske tilgange kan forankres parallelt i sådanne mikrofluidadskillelsesplatforme. Analytisk information om de adskilte forbindelser kan opnås med offline strategier såsom massespektroskopi eller SDS-PAGE, men teknikkerne kan begrænse behandlingshastigheden i en enkelt enhed, forårsage prøvetab eller kontaminering.

Saar et al. udviklede derfor fuldt integreret separation og kvantitativ karakterisering af heterogene biomolekylære prøver i en enkelt mikrofluidisk enhed for at overvinde de eksisterende grænser ved direkte at koble on-chip separation til on-chip analyse og molekylær størrelse. Designfunktionen tillod analyse af en specifik fraktion ved at justere den anvendte feltstyrke. De designede enheden til at identificere adskilte fraktioner svarende til SEC-MALS (størrelsesudelukkelseskromatografi med multi-vinkel lysspredning) eller LC (chip)-MS ((på-chip)-væskekromatografi-massespektrometri) metoder.

Enheden havde den yderligere fordel at udføre hele processen fuldt indgroet til elektroforetisk adskillelse i fri opløsning, giver forskere mulighed for at opnå et kvantitativt kort på få minutter - meget hurtigere end konventionelle teknikker. Blandingen var upåvirket af det bærende medium, og forskerne kunne studere både svage og ikke-kovalente molekylære interaktioner.

Saar et al. designet enheden ved hjælp af en native fase kvantitativ elektroforeseenhed forbundet med en mikrofluidisk diffusionsenhedsstørrelse (MDS) enhed. Den kombinerede platform tillod komponenter med specifik elektroforetisk mobilitet (µ _e1 ) til on-chip downstream analyse, som funktion af den påførte elektriske feltstyrke. De designede tre kanaler nedstrøms for elektroforeseenheden for at holde elektrolyseprodukter væk fra chippen uden at komme ind i enheden. De minimerede antallet af individuelle enheder, der drev flowet i enheden, koblet til stabil enhedsdrift til kvantitativ prøvekarakterisering. Forskerne holdt elektrolyttens udgange adskilt fra den kombinerede enhed for at påføre elektrisk potentiale på tværs af enheden uden at generere en elektrisk kortslutning, og at tillade effektiv fjernelse af ethvert elektrolyseprodukt uden akkumulering for at forhindre tryksvingninger.

Forskerholdet anvendte det elektriske potentiale på metalliske konnektorer til at generere en metal- og væskegrænseflade uden for chippen i overensstemmelse med enhedsprototypen designet af det samme hold. I dette arbejde, Saar et al. designet en Y-formet flowsplitter og holdt vandløbene adskilt, indtil de nåede splitteren for at forhindre delvis kortslutning. De beregnede strømningshastigheden af ​​elektrolytten ind i enheden for at have en effekt på enhedens ydeevne.

I alt, mikrofluidikplatformen med separationsenheden ledede en brøkdel af væskestrømmen til en MDS-enhed, som forskerholdet koblede til analytisk SEC-MALS for at identificere de fraktioner, der forlader separationsmodulet. For at analysere dataene og opnå gennemsnitlig molekylstørrelse for hver fraktion, de brugte en numerisk solver, der forudsagde genereringen af ​​partikelfordelinger. Saar et al. sammenlignede de forudsagte fordelinger med eksperimentelle data og udtog de hydrodynamiske radier af partiklerne i hver fraktion.

De afbildede dysen, hvor prøven mødte bæremediet, som et referencepunkt for partikelbevægelse. Forskerne justerede diffusionsdimensioneringskanalen eller strømningshastigheden for nøjagtigt at dimensionere analytmolekylerne, størrelsesordener større eller mindre i størrelse. Siden de konstruerede mikrofluidikplatformen ved hjælp af poly(dimethylsiloxane) (PDMS), forskerne eliminerede enhver autofluorescens i opsætningen, før de analyserede billeddataene.

De brugte derefter enheden til at analysere en binær blanding af prøveproteiner; bovint serumalbumin og humant lysozym. For at bevare proteinmolekylernes native tilstande afbildede de de mærkefri prøver med et hjemmebygget UV-bølgelængdebaseret mikroskop og kvantificerede prøvens iboende fluorescens. Saar et al. bekræftede evnen til at adskille blandingen i dens komponenter ved først at anvende et sæt spændinger for at registrere de fluorescerende profiler. De registrerede derefter de elektroforetiske mobiliteter af proteinerne (µ _e1 ) kombineret med strømningshastigheden i enheden for at karakterisere de fleste proteiner og deres komplekser. Forskerne ændrede flowhastigheden eller den påførte spænding for at analysere biomolekyler med forskellige biofysiske parametre.

Brug af platformen, de karakteriserede hurtigt blandinger af nanoskala molekyler, hvor individuelle analytter viste lignende størrelser, men forskellige elektroforetiske egenskaber. Baseret på det resulterende histogram, forskerholdet bekræftede tilstedeværelsen af ​​to forskellige prøver. Forholdsvis, i en off-chip konventionel separationstilgang, sidstnævnte trin krævede fraktionering ved prøveoverførsel fra et analyseværktøj til et andet via indbyrdes forbundne rør, begrænser enhedens ydeevne. Den samlede proteinkoncentration i undersøgelsen var tilnærmet 100 µM, og forskerne opdagede nøjagtigt følsomhedsgrænsen til cirka 100 nM, i forhold til den iboende fluorescens af proteinfraktioner. For optisk ikke-aktive forbindelser, Saar et al. foreslå en alternativ detektions- og karakteriseringsstrategi såsom tør masseføling.

Saar et al. brugt strategien til at opnå todimensionelle (2-D) karakteristiske kort over proteinblandingen som et proof-of-concept. De udtog kvantitativ information fra separationstrinnet og relaterede de anvendte potentialer til artens elektroforetiske mobiliteter for at estimere enhedens effektivitet. De registrerede strømmen, der flyder i systemet under normal drift, og når separationskammeret blev kortsluttet for at estimere den samlede elektriske modstand af enheden og elektroderne.

Forskerne beregnede den elektroforetiske mobilitet som bevægelsen af ​​en partikel i et elektrisk felt for hver af fraktionerne. Baseret på de eksperimentelle data, det konstruerede 2-D karakteristiske kort inkluderede den effektive ladning (q) og den hydrodynamiske radius (Rh) af blandingen. De resulterende elementære ladningsenheder af de specifikke proteiner stemte overens med estimerede værdier andre steder. De opnåede det fulde todimensionelle kort ved kun at overvåge en enkelt billedramme til hurtig analyse i opløsning.

Den analytiske tid for mikrofluidikanordningen fra adskillelse til diffusionsdimensionering og billeddannelse var cirka 14 sekunder. Forskerne konstruerede det eksperimentelle 2D-kort ved at bruge kun 3 µL prøve over syv minutter i alt, størrelsesordener hurtigere end tidsskalaen til at udføre konventionelle 2-D proteingeler. Forskerholdet gennemførte en bred vifte af biomolekylære interaktioner, i løsning, direkte under indfødte forhold, som tidligere var udfordrende at udføre i laboratoriet.

På denne måde Kadi L. Saar og kolleger udviklede en mikrofluidisk enhed, der kombinerer on-chip-separation med direkte on-chip-analyse for at erstatte de eksisterende konventionelle mikroskalametoder. Ved at bruge enheden, de analyserede hurtigt en binær blanding af proteiner, der ikke kunne identificeres som individuelle komponenter via eksisterende løsningsstørrelsesmetoder. De konstruerede et 2-D karakteristisk kort over den heterogene blanding på en hurtig tidsskala for at åbne muligheden for proteinkarakterisering i opløsning med en hidtil uset tidsopløsning sammenlignet med eksisterende biofysiske teknikker.

© 2019 Science X Network