Dyrkning af HCA -krystaller

Zoë Fisher og Katarina Koruza fra ESS Deuteration and Macromolecular Crystallization (DEMAX) Support lab og Lunds Universitet har brugt dampdiffusionsmetoder til at dyrke store proteinkrystaller til neutronteknikker som en del af SINE2020's Crystal Growth-arbejdspakke. Imidlertid, samt at være i stand til at dyrke krystaller store nok til disse teknikker, de vil også gøre dem deutererede. Deutererede versioner giver mulighed for forbedret signal-støjforhold, reduceret usammenhængende baggrund og brugen af ​​kontrastvariationsmetoder.

Holdet har forsøgt at lave store krystaller af forskellige proteiner, herunder membranproteinet Tomatthymidinkinase (TOTK1) og Superoxiddismutase (bSOD), som er til stede i alle organismer og er involveret i ældningsprocessen. Imidlertid, selvom de formåede at vokse flotte krystaller, var de bare ikke store nok – mindre end 0,1 mm3.

Men Zoë og Katarina har haft meget mere succes med humane kulsyreanhydrase (HCA) proteiner. Især HCA IX-proteinet er impliceret i cancermetastaser og er dukket op som et muligt mål for cancerdetektion, billeddannelse, og behandling. Neutronteknikker kunne give detaljer om det aktive sted - hydrogenbinding, vandorganisation, ligand-binding - der ville hjælpe med design af forbedrede kræftlægemidler.

Vildtype HCA II, HCA IX Mimic (hvor en del af HCA II-molekylet er blevet tilpasset til at efterligne det aktive sted af HCA IX-proteinet) og en HCA IX-overfladevariant (SV), som har 6 overflademutationer for at gøre det mere opløseligt og stabilt, var proteinerne valgt til projektet. Når det ikke er effektivt at lave deutererede proteiner ved at lave dem fra bunden eller købe dem kommercielt, de deutereres via H-D-udveksling, hvor det "gennemblødes" i en deutereret opløsning (buffer). Til dette arbejde blev de alle udtrykt i E.coli under hydrogenerede og deutererede betingelser for at lave H- og D-versioner.

De satte sig derefter for at krystallisere proteinerne ved hjælp af dampdiffusionsmetoder, så krystallerne kunne studeres ved hjælp af både røntgen- og neutronkrystallografi.

Dette var ikke en nem opgave. Proteiner er meget følsomme. Det var nødvendigt at bruge opstillinger, der er stabile i lange inkubations- og ækvilibreringsperioder. Temperaturen, fordampningshastigheder, pH- og protein- og bundfaldskoncentrationer skulle alle kontrolleres omhyggeligt ved hjælp af krystallisationsbrønde og automatisk kontrol, for eksempel at variere temperaturen op og ned efter behov.

Derudover for at gøre krystaller store nok til neutronkrystallografi, du skal bruge en stor mængde udgangsmateriale, typisk 100-500 mikroliter eller 100s mgs. Disse store mængder betyder, at krystalvæksten er langsom - så forholdene skulle kontrolleres i mange måneder ad gangen.

Desværre, krystaludbytterne opnået for de deutererede versioner var ikke så gode som for de hydrogenholdige versioner, regelmæssigt producerer færre og mindre krystaller. Det blev opdaget, at man for nogle deutererede proteiner slet ikke kunne bruge de betingelser, der fungerede for de hydrogenholdige versioner, og betingelserne skulle optimeres yderligere for at dyrke deutererede krystaller.

Men med udholdenhed, Zoë og Katarina har med succes formået at dyrke en HCA (IX) SV krystal over 1 mm3 og en 1,8 mm3 krystal af HCA (IX) mimik. De har nu kunnet opnå røntgenresultater og også neutronresultater fra LADI på ILL og iBIX i Japan.