Terbium (III)-doteret fluorescerende glas til biomedicinsk forskning

Optiske undersøgelser og manipulationer udgør ofte kernen i biologiske eksperimenter. I en ny rapport, der nu er offentliggjort i Videnskabens fremskridt , Kazuki Okamato og et team af forskere inden for farmaceutiske videnskaber, neurovidenskab, medicin, fysik og kunstig intelligens ved University of Tokyo, Japan, introducerede et nyt borosilikatglasmateriale indeholdende en sjælden jordart ion terbium (III) (Tb ³⁺ ). Materialet udsendte grøn fluorescens ved blåt lys excitation, meget som grønt fluorescerende protein (GFP) med bred kompatibilitet på tværs af biologiske forskningsmiljøer. Ved hjælp af mikropipetter lavet af terbium-doteret glas, Okamato et al. målrettede GFP-mærkede celler til enkeltcellet elektroporation, enkeltcellet transkriptomanalyse og patch-clamp-optagelsesforsøg under fluorescensmikroskopisk kontrol i realtid. Glasset viste også potentiel tredje harmonisk generation ved infrarød laser excitation, nyttig til online optisk målretning af fluorescensmærkede neuroner i neocortex in vivo. På denne måde det terbium-doterede glas forenklede flere procedurer i biologiske eksperimenter med bredere anvendelser inden for biomedicinsk forskning.

Udførelse af optiske undersøgelser in vivo

Optiske undersøgelser og cellemanipulationer i levende væv er udbredt i biologisk forskning med kapacitet til at afsløre forskellige egenskaber i celler og under intracellulær kommunikation. Mens genetisk mærkning har muliggjort identifikation af celler, der udtrykker fluorescerende proteiner, er det stadig vanskeligt at få adgang til fluorescerende mærkede celler ved hjælp af glaspipetter, da glas ikke er fluorescerende i det synlige område. For at løse disse tekniske problemer, Okamato et al. introducerede en ny sammensætning af borosilikatglas. De sjældne jordarters ioner udviste unik fluorescensemission med skarpe toppe i det synlige lysspektrum. Holdet fokuserede på terbium (III) (Tb ³⁺ ), som har komplekse energiniveaustrukturer og teoretisk forventes at udsende grøn fluorescens. Excitationsbølgelængden var nær den højeste synlighed for menneskelige øjne og tæt på den for grønt fluorescerende protein. Som resultat, pipetter lavet af terbium-doterede glas var nyttige til fluorescens-målrettede, enkeltcellemanipulation i biovidenskab.

Holdet udviklede borosilikatglasset ved at bruge 3,1 molprocent (mol%) terbiumoxid (Tb) ₂ O ₃ ). Terbium (Tb ³⁺ )-doteret glas udsendte grøn fluorescens synlig for det blotte øje, selv under lys i rummet. Den Tb ³⁺ -doteret glas havde en absorptionstop ved en bølgelængde på 484 nm, som ikke blev observeret i normalt borosilikatglas uden terbium. Forskerne producerede glaskapillærer og -pipetter, hvor det støbte glas fortsatte med at udsende grøn fluorescens. Ved hjælp af scanningselektronmikroskopi, holdet tjekkede pipettespidserne for eventuelle aberrationer, der kunne påvirke kvaliteten af ​​elektrofysiologiske optagelser. Okamato et al. Dernæst brugte de nye mikropipetter til at udføre enkeltcellet elektroporation af et rødt fluorescerende protein (tdTomato) ind i neuroner i organotypiske hippocampale skivestrukturer hos rotter. De så på pipetterne, der indeholdt den røde farvevektor og pyramideceller, der var minimalt mærket med forbedret GFP, ved brug af det samme optiske apparat. Forskerne fastgjorde pipettespidserne til cellerne og påførte elektriske impulser til elektroporation for at lette ekspressionen af ​​det røde farvestof efter 48 timer. Derefter, holdet udførte enkeltcellet RNA-sekventering med pipetterne i akutte skiver af musens primære motoriske cortex fra transgene mus.

Brug af de nye mikropipetter til in vitro patch clamp optagelser

Forskerne udførte derefter patch-clamp-optagelser fra primære kulturer af hippocampale neuroner, der var sparsomt mærket med GFP ved hjælp af en terbium-doteret pipette fyldt med et rødt fluorescerende farvestof (Alexa Fluor 594). Pipetterne fyldte med succes målcellerne med farvestoffet og holdt dem i helcellekonfigurationen. Holdet anvendte den samme metode til akutte hjerneskivepræparater, hvor neuroner var placeret dybere i mindre gennemsigtige væv end dyrkede neuroner. Når Okamato et al. lappede pyramideceller i de akutte hippocampale skiver ved hjælp af terbium-doterede pipetter, neuronerne viste normale aktionspotentialer som reaktion på korte aktuelle injektioner. Cellerne udviste normale spontane excitatoriske og inhiberende postsynaptiske strømme under spændingsklemmekonfigurationen. Mikropipetterne kunne bruges til langtidsstabile optagelser og var også nyttige til optagelser fra neuritter. Holdet registrerede tilbagepropagerende handlingspotentialer ved hjælp af opsætningen fra målrettede dendritter.

In vivo patch-clamp-optagelser ved hjælp af de terbium-doterede pipetter

Okamato et al. next characterized the nonlinear multiphoton excitation of terbium-doped glass using infrared light at wavelengths that were approximately double the single-photon excitation peak (484 nm) of terbium. Using a photomultiplier tube through a 495-to-540 nm band-pass filter, the team captured the green fluorescence emitted by terbium-doped pipettes. The emissions peaked at an excitation wavelength of 975 nm, suggesting that a laser wavelength corresponding to the value excited the glass through a two-photon absorption process. The scientists also noted another bright signal at 1300 nm excitation through a 410-to-450 band pass filter and suggested the signal to have likely arisen from third harmonic generation (THG). Based on the strong THG signal of the micropipettes, Okamato et al. conducted in vivo whole cell patch-clamp recordings with a multiphoton laser microscope. They simultaneously used the cells and terbium-doped pipette using dual-laser irradiation at 1, 040 nm and 1, 300 nm, henholdsvis, and recorded the injection-induced action potentials and spontaneous membrane fluctuations under the current-clamp configuration.

På denne måde Kazuki Okamato and colleagues invented a terbium-doped glass emitting green fluorescence signal strong enough to be visible to the naked eye. The material had similar characteristics to conventional borosilicate glass and did not display photobleaching or cytotoxicity. The new micropipettes allowed fluorescence manipulations such as optical targeting of single-cell electroporation, single-cell RNA sequencing and electrophysiological recordings. The glass also emitted third harmonic generation upon three-photon excitation, applicable for in vivo manipulation. The terbium-doped glass therefore provided a platform for multiple purposes in biomedical research including hitherto conventional patch-clamp recordings to open new frontiers in life sciences.

© 2021 Science X Network