En ny gelelektroforese teknik til hurtig biomarkørdiagnose via massespektrometri

Polyacrylamidgelelektroforese muliggør adskillelse af proteiner ekstraheret fra biologiske prøver i høj opløsning, men det kræver mere end en dag med forbehandling at genvinde de adskilte proteiner, der er fanget inde i gelen til påvisning ved massespektrometri. BAC-DROP, vores nye elektroforese -teknologi, bruger en opløselig form af polyacrylamidgel, hvilket gør det muligt at afslutte prøveforbehandling på cirka fem timer. Den udviklede teknologi vil muliggøre hurtig diagnose af vira og sygdomsproteinmarkører.

Massespektrometri (MS) er en kraftfuld metode til biomarkøranalyse, fordi den muliggør meget følsom og præcis måling af målmolekyler i kliniske prøver. Anvendelse af MS til klinisk diagnose, såsom nyfødt metabolisk screening, er gået fremad med fokus på metabolitmarkører. MS -måling af proteiner bruges i øjeblikket hovedsageligt til nye markøropdagelsesundersøgelser, men der er en stigende interesse for dens anvendelse i klinisk markørdiagnose som et alternativ til immunoassays.

MS-baseret kvantificering af proteinbiomarkører udføres hovedsageligt ved en bottom-up-tilgang ved hjælp af peptidfragmenter opnået ved enzymatisk proteinfordøjelse med trypsin. Standard fordøjelsesprotokoller kræver en reaktionstid på mere end 20 timer, hvilket er en hastighedsbegrænsende faktor i prøveforberedelsesarbejdsgange.

Selvom proteinkvantificering af MS er yderst følsom, plasma og serumproteom er meget komplekse, og interferens fra andre komponenter udgør en betydelig udfordring. Til påvisning af målmarkører med høj præcision, tilgange til forfjernelse af større serumproteinkomponenter såsom albumin eller selektiv berigelse af målmarkører ved hjælp af antistofkolonner er blevet rapporteret, men off-target-effekten på kvantitative resultater og vanskeligheden ved at behandle flere prøver er stadig forhindringer.

I dette studie, vi fokuserede på opløselige polyacrylamidgeler ved hjælp af N, N'-Bis (acryloyl) cystamin (BAC) som en tværbinder for at løse disse problemer. BAC tværbundne polyacrylamidgeler opløses let ved reduktionsbehandling, tillader genvinding af proteiner, der er undsluppet ind i opløsningen. Vi fandt ud af, at de genvundne proteiner var egnede til hurtig trypsinfordøjelse under høje temperaturforhold, og det lykkedes os at etablere en prøveforberedelsesmetode med høj gennemstrømning til MS-baseret biomarkørkvantificering, som vi kaldte BAC-DROP (BAC-Gel Dissolution to Digest PAGE-Resolved Objective Proteins).

Højopløselig proteomfraktionering med BAC-DROP er særlig effektiv til MS-kvantificering af målrettede spormarkørproteiner afledt af kliniske prøver. Ved at introducere BAC-DROP i den MS-baserede kvantificerings-arbejdsgang for det inflammatoriske biomarkør C-reaktive protein (CRP), vi var i stand til at fuldføre prøvens forbehandling på kun 5 timer og med succes kvantificere CRP fra en 0,5 µL human serumprøve. Vi lykkedes også med en serologisk diagnose af hepatitis B-virus (HBV) infektion ved HBsAg-kvantificering kombineret med BAC-DROP og MS. For nylig, interessen for MS -diagnose af virusinfektioner har været stærkt stigende, som eksemplificeret ved diagnosen COVID-19. Prøveforberedelsesmetoden med høj gennemstrømning ved BAC-DROP vist i denne undersøgelse vil ikke kun kunne anvendes på HBV, men også på andre prøver af infektiøse virussygdomme.