Dobbelt temperaturkontrolsystem til regulering af isoprenbiosyntese i bagegær

Bagegær, Saccharomyces cerevisiae, er blevet omfattende udviklet til at producere en lang række kemikalier, der ikke er naturligt produceret af gær, herunder den vigtige monomer for syntetisk gummi, isopren. Imidlertid er alle organismer naturligt udviklet til bedre overlevelse frem for maksimeret biosyntese af produkter af menneskelig interesse. S. cerevisiae er ikke en undtagelse. Forringet cellevækst blev observeret under dens konstruktion ved hjælp af pathway-kompartmentering for forbedret isoprenbiosyntese.

For at løse dette problem har forskere fra College of Chemical and Biological Engineering ved Zhejiang University udviklet et temperaturfølsomt dynamisk kontrolsystem til at regulere initieringstiden for isoprenbiosyntese under fermenteringen. Denne undersøgelse blev offentliggjort online i Grænser for kemisk videnskab og teknik .

Den native transkriptionelle aktivator Gal4p af S. cerevisiae blev konstrueret til at opnå temperaturfølsomhed, og i mellemtiden blev dens ekspression drevet af en varmechok-promotor. På denne måde blev der udviklet et dobbelt temperaturreguleringssystem, hvis anvendelse førte til begrænset ekspression af pathway-gener ved den optimale temperatur for cellevækst (30 °C) og øget genekspression, når kulturtemperaturen blev skiftet til den optimale temperatur for isoprensyntese (37 °C).

Den "kuldefølsomme" Gal4p-mutant, der spiller den vigtigste regulerende rolle, blev skabt af den nobelprisvindende instruerede evolution-teknologi. For at lette hurtig og nøjagtig udvælgelse af mutanterne med temperaturfølsomhed fra det tilfældige mutantbibliotek, der indeholder tusindvis af mutanter, blev der etableret en vækstindikeret high-throughput screeningsmetode baseret på cytotoksiciteten af ​​5-fluoruridin dannet ved URA3-katalyseret omdannelse af 5- fluor-orotinsyre. Den negative korrelation mellem Gal4p-aktivitet ved en bestemt temperatur og biomassen af ​​5-fluoruridin-akkumulerende stammer muliggjorde selektion af Gal4p-mutanter med lavere aktivitet ved 30 °C og højere aktivitet ved 37 °C.

Når den "kuldefølsomme" Gal4p-mutant blev udtrykt under kontrol af en varmechok-promotor, blev dens regulatoriske aktivitet ved den permissive temperatur yderligere øget på grund af det øgede ekspressionsniveau og den basale ekspression af pathway-generne ved den restriktive temperatur blev yderligere reduceret. Anvendelse af denne dobbelte temperaturkontrolstrategi førte til henholdsvis 34,5 % og 72 % forbedringer i cellevækst og isoprenproduktion af S. cerevisiae. Denne undersøgelse rapporterer skabelsen af ​​de første kuldefølsomme varianter af Gal4p ved styret evolution og giver et dobbelt temperaturkontrolsystem til gærteknologi, der også kan være befordrende for biosyntesen af ​​andre naturprodukter af høj værdi. + Udforsk yderligere

Transkriptionel reguleringsmekanisme for plantepektinbiosyntese