Forskere sporer proteinbinding, bygger syntetiske proteiner for at studere genekspression

Hvordan husker en næse, at det er en næse? Eller husker et øje, at det er et øje?

Mens forskere undersøger spørgsmålet om, hvordan celler husker, hvilken slags celler de formodes at være, eller deres genetiske afstamning, er det vigtigt at forstå, hvordan celler udtrykker forskellige gener uden at ændre selve DNA-sekvensen.

Men at studere dette emne er svært:Forskere kan rense de proteiner, der driver genetisk ekspression, lægge dem i et reagensglas og se dem binde. Men at gøre det inde i cellekernen, deres oprindelige miljø, har hidtil været umuligt.

Nu har et team af forskere ved tre laboratorier ved University of Michigan været i stand til at spore, hvordan et protein binder til dets kromatinsubstrat i en levende celle ved at etablere et samarbejde, der kombinerer avanceret ultrahøj opløsning billeddannelse, syntetisk protein design og beregningsmodellering. Deres resultater er offentliggjort i Science Advances .

"Det biologiske spørgsmål, som vi stiller, er:'Hvordan husker celler faktisk tidligere oplevelser? Og hvordan fører disse oplevelser også til, at celler etablerer forskellige identiteter, som det sker i tilfældet med den menneskelige krop, hvor du har cellelinjer, der danner neuroner, eller blodceller eller hjerneceller, og alle bevarer faktisk deres identitet i mange generationer," sagde hovedforfatter Kaushik Ragunathan, assisterende professor i biologisk kemi ved U-M Medical School.

"Et eksempel, jeg godt kan lide at tænke på, er, at hvis du hugger din næse af, får du ikke en hånd til at vokse der, selvom genomet i din næse og genomet i din hånd er nøjagtig det samme."

Celler styrer, hvordan og hvilke gener, der udtrykkes fra en kopi af DNA-sekvensen i hver celle, på trods af at sekvensen er den samme på tværs af alle celler i kroppen. En måde de kontrollerer ekspression på er ved at ændre, hvor tæt DNA'et er pakket i kernen ved hjælp af proteiner kaldet "histoner". Histoner kan modificeres gennem tilføjelse af små kemiske tags, der regulerer, hvor tæt DNA'et er viklet omkring dem og dermed om generne kan udtrykkes.

Proteiner, der har evnen til at læse, skrive og slette disse histonmærker, udforsker DNA'et i cellens kerne meget hurtigt - i størrelsesordenen millisekunder, ifølge Ragunathan. I sidste ende skal al denne epigenetiske information nedarves på tværs af generationer, men genkendelsen af ​​disse tags er en kompliceret proces, der involverer kromatinbinding og proteiner, der mødes og interagerer med hinanden midt i kaosset af alle andre mulige konkurrerende interaktioner i cellen.

At være i stand til at forstå hvert trin i processen – og derfor muliggøre kontrol over, hvordan den epigenetiske information nedarves – fascinerede medforfatter Julie Biteen, professor i kemi og biofysik.

Biteen bruger enkeltmolekyle fluorescensbilleddannelse til at spore individuelle proteiner inde i celler. Hendes laboratorium kan se, hvor disse proteiner er i forhold til kromatinet, og Ragunathans ekspertise er i de molekylære mekanismer, der understøtter, hvordan histonmodifikationer og histonbindende proteiner interagerer. Disse to verdener skulle mødes, så biokemien af, hvad der sker i et reagensglas uden for cellerne, kunne testes for at finde ud af, hvad der sker inde i dem.

"Timingen af ​​denne proces er kritisk vigtig for at sikre, at de rigtige gener dæmpes på det rigtige sted og på det rigtige tidspunkt," sagde Biteen. "Det, der fangede mig på dette projekt, er, at du in vitro - i et reagensglas - kan rense to proteiner, se dem binde og se, hvor god den binding er, eller hvad er affiniteten for hinanden. Det fortæller dig, hvad der kan ske i cellerne, men ikke hvad der sker i cellerne."

Biteen og Ragunathan arbejdede sammen med Peter Freddolino, lektor i biologisk kemi og beregningsmedicin og bioinformatik ved U-M Medical School, for at kombinere computermodellering med deres eksperimentelle resultater.

"Det er virkelig her, vores samarbejde bliver virkelig kraftfuldt," sagde Biteen. "På den ene side er det meget nyttigt at se molekyler, og at vide, hvor hurtigt molekylerne bevæger sig, hjælper meget i forhold til at forstå, hvad der er muligt inde i cellen, men her kunne vi tage et spring fremad ved at forstyrre systemet selv på unaturlige måder for at forstå, hvad disse forskellige bevægelser af molekyler i cellen faktisk betyder."

Mens epigenetiske mærker er enormt vigtige for at opretholde forskellige væv i komplekse organismer som mennesker, spiller de også en vigtig rolle i reguleringen af ​​gener fra encellede organismer såsom gær. Holdet fokuserede på en type HP1-protein i gærceller kaldet Swi6. Denne familie af proteiner binder sig til en specifik type histonmodifikationer i cellen for at fremtvinge gendæmpning. Ved at integrere fluorescerende etiketter med Swi6, så Bitees laboratorium Swi6 bevæge sig inde i cellens kerne.

Mens Swi6 søger efter det korrekte bindingssted på DNA, bevæger det sig hurtigt, sagde Biteen. Når den finder sit mål, sænker den farten betydeligt. Bevægelsen af ​​et protein i cellen er beslægtet med gear i en bil, og ting kan bevæge sig med forskellige hastigheder baseret på, hvem proteiner interagerer med.

"Ud fra disse spaghettispor, som vi får inde i cellen, finder vi så ud af, hvor meget tid de bruger på at søge, og hvor meget af tiden de bruger bundet," sagde Biteen. "Den tid, de bruger på ikke at bevæge sig, fortæller os om, hvor stærkt de interagerer og deres biokemiske egenskaber."

Mens Biteens laboratorium kan måle bevægelser i cellen på en skala fra titusinder af millisekunder, sker meget af den biokemi, der sker i cellen, endnu hurtigere, sagde hun. Freddolino tog denne eksperimentelle information og udviklede modeller til at estimere Swi6-proteinernes evne til at springe mellem de bindingstilstande, der blev identificeret i eksperimenter.

Freddolinos modellering tog højde for de eksperimentelle målinger og de mulige biokemiske egenskaber, som inkluderer hvordan Swi6-molekylerne interagerer i cellen. Disse interaktioner omfatter molekyler, der frit flyder i cellens opløsning, molekyler, der har bundet sig til DNA, og molekyler, der "holder i hånd" med hinanden, sagde han.

"Mit laboratorium ønskede at komme op med en mere finkornet model, der estimerede, hvad der var det mest sandsynlige sæt af molekylære tilstande af proteinerne og deres evne til at springe mellem disse tilstande, som så ville give anledning til de billeddata, som Biteens laboratorium skabte " sagde Freddolino.

"At have denne numeriske model giver os mulighed for at lave beregningseksperimenter med, hvad der sker, hvis proteinbindingen er dobbelt så hurtig, som vi tror. Hvad hvis den er 10 gange så hurtig, som vi tror? Eller 10 gange langsommere? Kan det stadig give anledning til data? Meget lykkeligt var vi i dette tilfælde i stand til at vise, at de relevante processer virkelig blev fanget i fluorescensmikroskopi."

Efter at have identificeret de bindende egenskaber af naturlig Swi6, testede forskerne deres resultater ved at omdesigne Swi6 fra dets komponenter for at se, om de kunne replikere nogle af dets biokemiske egenskaber, sagde Ragunathan. Dette gjorde det muligt for forskerne at fastslå, at billeddannelsen og modelleringen, der blev udført i den første del af papiret, afspejler, hvordan proteinet var bindende i dets oprindelige miljø.

"Kan vi gøre, hvad naturen gjorde i løbet af millioner af år og lave et protein, der på mange måder har egenskaber, der ligner Swi6s i celler?" sagde Ragunathan. "In vivo biokemi, som vi har besluttet at kalde dette, var ikke noget, man nogensinde troede var muligt inde i levende celler, men vi har vist, at dette er fuldstændigt muligt ved at bruge billeddannelse som en modalitet. Vi bruger dette projekt. som et fundament for at forstå, hvordan disse epigenetiske tilstande kan etableres og opretholdes på tværs af generationer." + Udforsk yderligere

At lære af den enkelte celle:En ny teknik til at optrevle genregulering