Reversibel kemoenzymatisk mærkningsstrategi muliggør dybdegående analyse af protein O-GlcNAcylering

O-bundet β-N-acetylglucosamin (O-GlcNAcylation), en vigtig post-translationel modifikation (PTM) af proteiner, er involveret i forskellige biologiske funktioner.

Den reversible modifikation af O-GlcNAc giver on-off proteinfunktioner under biologiske processer. Aberrationer af O-GlcNAcylering er tæt forbundet med mange stofskiftesygdomme sammen med invasionen og metastasen af ​​flere tumorer.

For nylig har et forskerhold ledet af prof. Ye Mingliang og prof. Qin Hongqiang fra Dalian Institute of Chemical Physics (DICP) ved det kinesiske videnskabsakademi (CAS) i samarbejde med prof. Huang Wei fra Shanghai Institute of Materia Medica af CAS, udviklede en ny strategi for reversibel kemoenzymatisk mærkning af O-GlcNAc-glycopeptider, som muliggjorde dybdegående analyse af protein O-GlcNAcylering.

Deres resultater blev offentliggjort i Angewandte Chemie den 14. marts.

For at muliggøre proteom-dækkende analyse af O-GlcNAcylering er det vigtigt at berige glycopeptider selektivt fra fordøjelsen af ​​komplekse prøver.

Mange forskere har søgt berigelse af O-GlcNAcylerede peptider før analyse ved væskekromatografi med tandem massespektrometri (LC-MS/MS). Imidlertid lider de fleste af tilgangene af svag bindingsaffinitet eller voluminøse tags, som interfererer med berigelsen og identifikationen af ​​O-GlcNAcylerede peptider.

I denne nyudviklede strategi blev O-GlcNAc-delene ligeret med lange N-glycaner under anvendelse af en Endo-M-mutant, som muliggjorde berigelse af de mærkede glycopeptider ved hydrofil interaktionsvæskekromatografi (HILIC). Derefter blev de vedhæftede glycaner på de berigede glycopeptider fjernet med vildtype Endo-M/S for at genoprette O-GlcNAc-delen.

Sammenlignet med den klassiske kemoenzymatiske mærkning muliggjorde denne tilgang tag-fri identifikation og eliminerede interferensen af ​​voluminøse tags i glycopeptiddetektion.

Ved at bruge denne metode identificerede forskerne desuden 657 potentielle O-GlcNAc-glykosider fra kun 0,4 mg HeLa-cellekerneproteiner, hvilket kun var nødvendigt med 1/10 af proteinprøver til en sammenlignelig O-GlcNAcyleringsanalyse, hvilket indikerer den høje følsomhed af dette metode.

I alt identificerede de 1.414 glykosider fra kun 1,1 mg proteinprøver, og 45 % af dem var ikke inkluderet i O-GlcNAcAltas af alle menneskelige prøver i de sidste 35 år, hvilket forbedrede analysedækningen af ​​protein O-GlcNAcylering.

"Denne tag-fri berigelse strategi repræsenterer en unik mulighed for proteom-dækkende analyse af O-GlcNAcylation og fremmer mekanisme undersøgelser," sagde Prof. Ye. + Udforsk yderligere

De molekylære mekanismer ved Alzheimers