Formålet med bufferen i Electrophoresis

Biokemister og molekylærbiologer bruger elektroforese til at adskille makromolekyler som proteiner og nukleinsyrer. Dette gør det muligt for forskere at isolere og analysere individuelle proteiner eller nukleinsyresekvenser i en kompleks blanding. Et typisk eksempel på elektroforese i laboratoriet er en mikrobiolog ved anvendelse af polymerase-kædereaktion (PCR) til at separere DNA-fragmenter produceret i et mikrobielt samfund. Uanset formålet kræver elektroforese altid brugen af ​​en bufferopløsning.

TL; DR (for lang, ikke læst)

Elektroforese adskiller makromolekyler som protein og nukleinsyrer efter størrelse, opladning og andre egenskaber. For elektroforese, der adskiller ved ladning, bruger forskere buffer til at overføre denne ladning gennem gelen. Bufferen opretholder også gelen ved en stabil pH, hvilket minimerer de ændringer, der kan forekomme i proteinet eller nukleinsyren, hvis den udsættes for ustabil pH.

Principer for elektroforese

Elektroforese adskiller molekyler langs en gradient baseret på deres størrelse, ladning eller andre egenskaber. Denne gradient kan være et elektrisk felt eller, i tilfælde af denatureringsgradientgelelektroforese (DGGE), en denaturant, såsom en blanding af urinstof og formamid. Proteiner vil migrere mod anoden, hvis de er negativt ladede, og katoden er positivt ladet. Da større molekyler migrerer langsommere end mindre molekyler, kan forskere måle afstanden og bruge logaritmer til at bestemme størrelsen af ​​fragmenterne.

Denaturerende Gradientelektroforese

Med DGGE flytter DNA langs en gradient af stigende denatureringskraft indtil strømmen er tilstrækkelig til at denaturere eller udfolde det pågældende DNA-fragment helt. På dette tidspunkt stopper overførslen. Forskere kan bruge denne metode til at adskille fragmenter baseret på deres individuelle modtagelighed for denaturering.

Hvad bufferen gør

I tilfælde af elektroforese, der adskiller på basis af ladning, sender ioner i bufferen afgiften er nødvendig for adskillelse. Bufret, ved at tilvejebringe et reservoir af svag syre og base, holder også pH inden for et snævert område. Dette er vigtigt, fordi strukturen og ladningen af ​​et protein eller en nukleinsyre vil ændre sig, hvis den udsættes for signifikante pH-ændringer, og dermed forhindre korrekt adskillelse.

Typiske buffere

Forskellige buffere er ideelle til opretholdelse af elektroforese gel ved forskellige ønskede pH-intervaller. Typiske buffere anvendt af forskere til dette formål indbefatter eddikesyre, borsyre, phosphorsyre og citronsyre såvel som glycin og taurin. Generelt bør pKa-værdien (syre dissociationskonstant) være tæt på den ønskede pH. Det er at foretrække for os buffere, der giver en lav opladningsstørrelse for ikke at udføre for meget strøm.