Hvad er en følgende reaktioner, der bruges til radioaktivt at mærke DNA?

1. Nick -oversættelse:

* reaktion: Denne metode bruger enzymet DNA -polymerase I At erstatte nukleotider i en DNA -streng med mærkede nukleotider. Det fungerer ved at introducere enkeltstrengede pauser (nicks) i DNA'et ved hjælp af DNase I . Polymerasen bruger derefter nikken som en primer og inkorporerer mærkede nukleotider i kløften.

* isotoper: Almindelige anvendte isotoper er ³²p-dctp eller ³²p-datp .

* Fordele: Producerer høj specifik aktivitet (etiketdensitet) og er velegnet til både enkelt- og dobbeltstrenget DNA.

* Ulemper: Kræver et specifikt enzym og kan være følsomt over for bufferforholdene.

2. Tilfældig primermærkning:

* reaktion: Denne metode bruger korte tilfældige oligonukleotidprimere og DNA -polymerase I (Klenow Fragment) til syntetiserende en ny DNA -streng komplementær til skabelonstrengen. Polymerasen inkorporerer mærkede nukleotider under syntesen.

* isotoper: Almindelige anvendte isotoper er ³²p-dctp eller ³²p-datp .

* Fordele: Effektiv og kan bruges til at mærke både enkelt- og dobbeltstrenget DNA.

* Ulemper: Kan introducere en vis baggrundsmærkning på grund af den tilfældige primerbinding.

3. Slutmærkning med kinaser:

* reaktion: Denne metode bruger polynukleotidkinase At tilføje en phosphatgruppe i 5 'enden af et DNA -fragment. Fosfatgruppen er mærket med en radioaktiv isotop.

* isotoper: Typisk ³²p-atp eller ³³p-atp bruges.

* Fordele: Enkel og ligetil, især nyttig til mærkning af korte DNA -fragmenter.

* Ulemper: Kun etiketter 5 'enden af DNA.

4. PCR -mærkning:

* reaktion: Denne metode involverer anvendelse af radioaktive dntps (såsom ³²p-dctp ) under PCR -reaktionen. Dette inkorporerer etiketten i de nyligt syntetiserede DNA -strenge.

* isotoper: Almindelige anvendte isotoper er ³²p-dctp eller ³²p-datp .

* Fordele: Effektiv og kan bruges til at mærke specifikke DNA -sekvenser.

* Ulemper: Kan være mindre effektiv end andre metoder og kan være vanskelige at opnå høj specifik aktivitet.

5. In vitro -transkription:

* reaktion: Bruger RNA -polymerase Sådan transkribere en DNA -skabelon til RNA. RNA er mærket med radioaktive nukleotider under syntesen.

* isotoper: Typisk ³²p-Utp eller ³⁵s-utp .

* Fordele: Kan producere højt mærkede RNA -prober til hybridiseringsundersøgelser.

* Ulemper: Kræver specialiserede reagenser og betingelser for in vitro -transkription.

Valget af mærkningsmetode afhænger af den specifikke anvendelse og de ønskede egenskaber ved det mærkede DNA.

Bemærk: Brugen af radioaktive isotoper er faldet i de senere år på grund af sikkerhedsmæssige bekymringer og tilgængeligheden af ikke-radioaktive mærkningsmetoder. Radioaktiv mærkning har dog stadig nogle fordele i visse anvendelser, især for følsomhed og evnen til at detektere mål med lav overflod.