Forskere skruer op for lysstyrken på fluorescerende sonder

Forskere fra Carnegie Mellon University's Molecular Biosensor and Imaging Center (MBIC) skruer op for lysstyrken på en gruppe af fluorescerende prober kaldet fluoromoduler, der bruges til at overvåge biologiske aktiviteter af individuelle proteiner i realtid. Dette seneste fremskridt forbedrer deres fluormodulteknologi ved at få det til at lyse en størrelsesorden lysere end typiske fluorescerende proteiner. De nye fluoromoduler er fem til syv gange lysere end forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP), en udvikling, der åbner nye veje for forskning.

I et papir offentliggjort online i Journal of the American Chemical Society , MBIC-forskere afslører en ny klasse af dendron-baserede fluorogene farvestoffer kaldet "dyedroner, ", der forstærker signalet udsendt af deres fluoromoduler.

"Ved at bruge begreber lånt fra kemi, de samme begreber, der bruges i ting som kvanteprikker og solceller, der høster lys, vi var i stand til at skabe en struktur, der fungerer som en antenne, intensivering af fluorescensen af ​​hele fluormodulet, sagde Marcel Bruchez, lektor i kemi og MBIC-programleder.

MBIC's fluormoduler er opbygget af et farvestof kaldet et fluorogen og et fluorgenaktiverende protein (FAP). FAP er genetisk udtrykt i en celle og forbundet med et protein af interesse, hvor det forbliver mørkt, indtil det kommer i kontakt med dets tilhørende fluorogen. Når proteinet og farvestoffet binder, komplekset udsender en fluorescerende glød, giver forskere mulighed for nemt at spore proteinet på celleoverfladen og i levende celler. Fluoromoduler er unikke ved, at de ikke behøver at blive vasket af for specifik mærkning, de kommer i et spektrum af farver, og de er mere fotostabile end andre fluorescerende proteiner.

For at gøre fluoromodulerne lysere, forskerne forstærkede signalet fra en af ​​deres eksisterende sonder. De tog et af deres standard fluorogener, malakit grøn, og kombineret det med et andet farvestof kaldet Cy3 i et kompleks, som forskerne kaldte en "farvedron". Dyedronen er baseret på en speciel type trælignende struktur kaldet en dendron, med et malakitgrønt molekyle, der fungerer som stammen, og flere Cy3-molekyler, der fungerer som grenene.

De to farvestoffer har overlappende emissions- og absorptionsspektre - Cy3 udsender typisk energi ved en bølgelængde, hvor malakitgrøn absorberer energi - og denne overlapning gør det muligt for farvestofferne effektivt at overføre energi mellem hinanden. Når Cy3-farvestofmolekylerne bliver exciteret af en lyskilde, såsom en laser, de "donerer" straks deres excitationsenergi til malakitgrøn, booste signalet, der udsendes af malakitgrønt.

Hver dyedron er cirka 1-2 nanometer og 3000 g/mol i størrelse. De meget lyse, men meget lille, farvestofpartikler giver forskerne mulighed for at udvide deres forskning i levende celler. Tidligere, når der udføres mikroskopiske eksperimenter med fluorescerende proteiner, fluoromoduler og fluorescerende farvestoffer, hvis forskere ønskede at øge lysstyrken, de ville enten øge intensiteten af ​​laseren, der blev brugt til at visualisere proteinerne eller mærke proteinet, der studeres, med adskillige kopier af det fluorescerende tag. Begge metoder havde potentialet til at ændre biologien af ​​det system, der blev undersøgt, enten gennem den mere intense energi, der kommer fra laseren, eller den øgede vægt forårsaget af de flere tags, der er tilføjet til proteinet. Den nye tilgang giver et enkelt kompakt proteinmærke med signalforstærkning tilvejebragt ved kun beskedent at forstørre det målrettede farvestofmolekyle.

MBIC-forskerne bruger i øjeblikket fluormoduler til at studere proteiner på celleoverfladen, og håber at tage teknologien ind i celler i den nærmeste fremtid. Derudover de vil skabe dyedroner til deres andre eksisterende FAP/farvestofkomplekser.