Komprimeret sensing muliggør mikroskopi med superopløsning af levende cellestrukturer

(Phys.org) - Forskere fra Georgia Institute of Technology og University of California San Francisco har avancerede videnskabsmænds evne til at se et klart billede af en enkelt cellulær struktur i bevægelse. Ved at identificere molekyler ved hjælp af komprimeret sansning, denne nye metode giver den nødvendige rumlige opløsning plus en hurtigere tidsmæssig opløsning end tidligere muligt.

På trods af mange resultater inden for superopløsningsmikroskopi i de sidste par år med fremskridt i rumlig opløsning, live-cell imaging er fortsat en udfordring på grund af behovet for høj tidsmæssig opløsning.

Nu, Lei Zhu, assisterende professor ved Georgia Techs George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, og Bo Huang, adjunkt i UCSF's Institut for Farmaceutisk Kemi og Institut for Biokemi og Biofysik, har udviklet en avanceret tilgang ved hjælp af superopløsningsmikroskopi til at løse cellulære træk en størrelsesorden mindre end hvad der kunne ses før. Dette giver forskerne mulighed for at udnytte tidligere utilgængelige oplysninger og besvare nye biologiske spørgsmål.

Forskningen blev offentliggjort 22. april, 2012 i bladet Naturens metoder . Forskningen er finansieret af National Institutes of Health, UCSF-program for banebrydende biomedicinsk forskning, Searle Scholarship og Packard Fellowship for Science and Engineering.

Den tidligere teknologi, der anvender enkeltmolekyle-switching-tilgangen til superopløsningsmikroskopi, afhænger af at sprede enkeltmolekylebilleder sparsomt til mange, ofte tusindvis af, kamerarammer. Det er ekstremt begrænset i sin tidsmæssige opløsning og giver ikke mulighed for at følge dynamiske processer i levende celler.

"Vi kan nu bruge vores opdagelse ved hjælp af superopløsningsmikroskopi med sekunder eller endda sub-sekund tidsmæssig opløsning til et stort synsfelt til at følge mange flere dynamiske cellulære processer, " sagde Zhu. "Meget af vores viden om en celles liv kommer fra vores evne til at se de små strukturer i den."

Huang bemærkede, "En ansøgning, for eksempel, er at undersøge, hvordan mitokondrier, cellens krafthus, interagerer med andre organeller og cytoskelettet for at omforme strukturen under cellens livscyklus."

I øjeblikket, lysmikroskopi, især i den moderne form for fluorescensmikroskopi, bruges stadig hyppigt af mange biologer. Imidlertid, forfatterne siger, konventionel lysmikroskopi har én væsentlig begrænsning:manglende evne til at opløse to objekter tættere på end halvdelen af ​​lysets bølgelængde på grund af det fænomen, der kaldes diffraktion. Med diffraktion, billederne ser slørede og overlappede ud, uanset hvor høj forstørrelsen der bruges.

"Diffraktionsgrænsen har længe været betragtet som en af ​​de grundlæggende begrænsninger for lysmikroskopi indtil de seneste opfindelser af super-opløsnings fluorescensmikroskopiteknikker, " sagde Zhu. Super-opløsning mikroskopi metoder, såsom stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM) eller fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM), stole på evnen til at registrere lysemission fra et enkelt molekyle i prøven.

Ved hjælp af probemolekyler, der kan skiftes mellem en synlig og en usynlig tilstand, STORM/PALM bestemmer placeringen af ​​hvert molekyle af interesse. Disse positioner definerer i sidste ende en struktur.

Det nye fund er vigtigt, sagde Zhu og Huang, fordi de har vist, at teknologien giver mulighed for at følge dynamikken i et mikrotubuli-cytoskelet med en tre-sekunders tidsopløsning, hvilket ville give forskere mulighed for at studere de aktive transporter af vesikler og andre laster inde i cellen.

Ved at bruge det samme optiske system og detektor som ved konventionel lysmikroskopi, superopløsningsmikroskopi kræver naturligvis længere indsamlingstid for at opnå mere rumlig information, fører til en afvejning mellem dets rumlige og tidsmæssige opløsning. I superopløsningsmikroskopimetoder baseret på STORM/PALM, hvert kamerabillede prøver en meget sparsom undergruppe af probemolekyler i prøven.

En alternativ tilgang er at øge tætheden af ​​aktiverede fluoroforer, så hver kameraramme prøver flere molekyler. Imidlertid, denne høje tæthed af fluorescerende pletter får dem til at overlappe hinanden, invalidering af den meget anvendte enkelt-molekyle lokaliseringsmetode.

Forfatterne sagde, at en række metoder er blevet rapporteret for nylig, der effektivt kan hente enkelt-molekyle positioner, selv når de enkelte fluorofor-signaler overlapper. Disse metoder er baseret på tilpasning af klynger af overlappende pletter med et variabelt antal point-spread-funktioner (PSF'er) med enten maksimal sandsynlighedsestimation eller Bayesiansk statistik. Den Bayesianske metode er også blevet anvendt på hele billedsættet.

Som et resultat af ny forskning, Zhu og Huang præsenterer en ny tilgang baseret på global optimering ved hjælp af komprimeret sensing, som ikke involverer estimering eller antagelse af antallet af molekyler i billedet. De viser, at komprimeret sensing kan arbejde med meget højere molekyletætheder sammenlignet med andre teknologier og demonstrerer levende cellebilleddannelse af fluorescerende proteinmærkede mikrotubuli med tre sekunders tidsmæssig opløsning.

STORM-eksperimentet brugt af forfatterne, med immunfarvede mikrotubuli i Drosophila melanogaster S2-celler, demonstreret, at nærliggende mikrotubuli kan løses ved komprimeret sensing ved brug af så få som 100 kamerarammer, hvorimod de ikke kunne skelnes ved enkeltmolekyletilpasningsmetoden. De har også udført levende STORM på S2-celler, der stabilt udtrykker tubulin fusioneret til mEos2.

Ved den almindeligt anvendte kameraets billedhastighed på 56,4 Hertz, en film i superopløsning blev konstrueret med en tidsopløsning på tre sekunder (169 billeder) og en Nyquist-opløsning på 60 nanometer, meget hurtigere end tidligere rapporteret, sagde Zhu og Huang. Disse resultater har bevist, at komprimeret sensing kan sætte STORM i stand til at overvåge levende cellulære processer med andenskala tidsopløsning, eller endda opløsning i undersekund, hvis et hurtigere kamera kan bruges.