Lysere, mindre prober for at afdække proteiners hemmelige liv

(Phys.org) -- Forestil dig at spore en hjort gennem en skov ved at klippe en radiosender til øret og overvåge hjortens placering på afstand. Forestil dig nu, at senderen er på størrelse med et hus, og du forstår det problem, forskere kan støde på, når de forsøger at bruge nanopartikler til at spore proteiner i levende celler.

At forstå, hvordan et protein bevæger sig rundt i en celle, hjælper forskerne med at forstå proteinets funktion og de cellulære mekanismer til fremstilling og behandling af proteiner. Denne information hjælper også forskere med at studere sygdom, hvilket på cellulært niveau kan betyde, at et protein ikke fungerer, holder op med at blive lavet, eller sendes til den forkerte del af cellen. Men nanopartikelprober, der er for store, kan forstyrre et proteins normale aktiviteter.

Nu er et team af forskere ledet af Bruce Cohen fra Lawrence Berkeley National Laboratory's Molecular Foundry, et U.S. Department of Energy (DOE) nanovidenskabscenter, har fundet ud af, hvordan man dyrker lysemitterende nanokrystaller små nok til ikke at forstyrre celleaktivitet, men lyse nok til at blive afbildet én ad gangen. Cohen er den korresponderende forfatter til et papir i den 16. februar, 2012 udgave af ACS Nano beskriver dette værk med titlen, "Kontrolleret syntese og enkelt-partikel billeddannelse af lys, Sub-10 nm Lanthanid-dopede opkonverterende nanokrystaller." Medforfattere er Alexis Ostrowski, Emory Chan, Daniel Gargas, Elan Katz, Gang Han, James Schuck, og Delia Milliron.

"Forskere har i årevis forsøgt at studere proteinadfærd ved at mærke dem med lysemitterende prober, sagde Cohen. "Men problemet er at finde den rigtige type sonde. Vores tilgang er at gøre opkonverterende nanopartikel-prober små nok til, at de ikke bør forstyrre proteinadfærd."

At lave en bedre sonde

I fortiden, forskere brugte fluorescerende molekyler eller kvanteprikker som prober. Bruger avanceret optik og mikroskoper, forskere kan opløse lys, der kommer fra enkelte molekyler knyttet til proteiner, som fortæller dem, hvor proteinet er i en celle. Probemolekylerne i disse eksperimenter har en tendens til at nedbrydes eller "fotoblege" hurtigt, begrænser forskerne til blot et par sekunders kontinuerlig billeddannelse eller en række billeder taget med sekunders mellemrum. De alternative sonder, kvanteprikker, lider mindre af fotoblegning, men i stedet flimrer de til og fra, på samme måde begrænser deres anvendelighed som prober.

Støberiet ville undgå både at blinke og blege, så de vendte sig til nanokrystaller af natriumyttriumfluorid (NaYF ₄ ) med spormængder af lanthanidelementer ytterbium og erbium, hvilken, de opdagede, udsender lyst, konstant lys ideel til bioimaging. Vigtigere, disse nanokrystaller "opkonverterer" lys, absorberer lavenergifotoner og genudsender dem ved højere energier.

"Når noget fluorescerende absorberer lys, udsender det typisk lys med en lidt lavere energi. Opkonvertering går den anden vej, faktisk øge energien af ​​det lys, der udsendes, sagde Cohen. "I vores tilfælde er vi spændende med lys med ret lav energi, nær infrarød (ud over rødt i det synlige spektrum), og så udsender nanokrystallerne lys i det synlige område, som grøn eller rød, som faktisk er højere i energi."

Fordelen ved at opkonvertere nanokrystaller er, at celler ikke selv opkonverterer lys. Normalt når videnskabsmænd afbilder en celle ved hjælp af molekylære prober, de bruger lys med synlig bølgelængde til både at ophidse og billede. Desværre, mange ting i cellen genudsender også absorberet lys ved disse bølgelængder, som skaber baggrundsstøj i billedet og tvinger videnskabsmænd til at bruge flere sonder og lysere lyskilder. Med opkonverterende nanokrystaller, forskere kan forsigtigt stimulere med infrarødt lys og se på synligt lys fra enkelte prober, der står tydeligt mod en mørk baggrund.

"Den anden fordel ved at opkonvertere nanokrystaller er, at nær-infrarødt lys er meget mindre skadeligt for celler end, sige, synligt eller ultraviolet lys, sagde Cohen. "Det betyder, at når vi laver disse meget lange billedeksperimenter ved at bruge intens lysstyrke til at se enkelte molekyler, vi bruger bølgelængder, der er ret godartede for celler."

En kombinatorisk løsning

Nanokrystaller af NaYF ₄ kan dannes i to forskellige geometrier kaldet alfa og beta. Beta-fase nanokrystallerne er mere effektive til opkonvertering og dermed bedre til biobilleddannelse, men de er også sværere at dyrke. For at fastgøre vækstparametrene for at få reproducerbar beta-NaYF ₄ nanokrystaller, holdet brugte Molecular Foundry's WANDA-robot – Workstation for Automated Nanomaterial Discovery and Analysis – udviklet af Berkeley Labs Emory Chan og Delia Milliron.

"Intet af dette ville være muligt uden at være i stand til at gøre det, vi på Støberiet kalder kombinatorisk nanovidenskab. Dybest set betyder det at køre mange og mange forskellige reaktioner i WANDA for at lære at kontrollere størrelsen eller farven på nanopartiklerne, sagde Cohen. "Vi har kørt tusindvis af forskellige reaktioner for at lære at dyrke disse ting."

Mindre nanopartikler betyder mindre lys, så holdet måtte finde det søde sted:

Hvor små kunne de gøre dem og stadig være i stand til at afbilde individuelle nanokrystaller i et levende system? "Det er en af ​​de gode ting ved at have denne kontrol er, at vi ikke kun kan få dem ned til, sige, 5 nanometer, men vi kender også betingelserne for at gøre dem større, hvis vi skal gøre dem lysere, sagde Cohen.

For at hjælpe med at forstå geometrien af ​​deres nanokrystaller, medforfatter James Schuck bad en sommerpraktikant om at lave en computermodel af krystalstrukturen. Andrew Mueller, en gymnasieelev fra Vistamar School i Los Angeles, gik dog langt ud over en simpel krystalstruktur.

"Jeg startede med bare at sætte former sammen baseret på, hvad der stod i litteraturen om krystallen, sagde Mueller. "Så ville jeg vise, hvordan det så ud i en nanokrystal, så jeg flyttede kameraet rundt i strukturen og panorerede ud for at vise, hvordan atomer samles i en nanokrystal." Mueller tilføjede senere animation af to fotoner, der blev absorberet og opkonverteret til en enkelt udsendt foton.

"Videoen er et godt svar på spørgsmålet, hvad er en nanokrystal?” sagde Cohen. "Du kan se, at dette i virkeligheden kun er nogle få hundrede eller måske et par tusinde atomer i en nanokrystal, arrangeret i små, regelmæssige mønstre."

Næste, holdet ønsker at sætte de opkonverterende nanokrystaller til handling og faktisk kortlægge enkelte proteiner, der bevæger sig gennem en celle. "En af de ting, vi gerne vil studere, er, hvordan to neuroner kommer sammen, hvordan to hjerneceller samles for at danne en synapse - mellemrummene mellem neuroner, der er ansvarlige for al hjerneaktivitet, sagde Cohen. "Det er kendt, at der er visse par af proteiner, der kommer sammen fra to neuroner, og de finder hinanden og danner en synapse, men spørgsmålet er, hvor mange af dem skal du bruge? Hvor mange par proteiner? Er kun én interaktion nok til at få en synapse til at dannes, vender de sig selv, og så videre? Nu hvor vi ved, hvordan man laver præcis de nanopartikler, vi ønsker, næste skridt er at teste dem i en celle."

Dette arbejde blev støttet af US Department of Energy Office of Science.