Forskere rapporterer om en ny tilgang til elektronisk DNA-sekventering af enkeltmolekyler

(Phys.org)—DNA-sekventering er drivkraften bag nøgleopdagelser inden for medicin og biologi. For eksempel, den komplette sekvens af et individs genom giver vigtige markører og retningslinjer for medicinsk diagnostik og sundhedspleje. Indtil nu, den største blokering har været omkostningerne og hastigheden ved at opnå meget nøjagtige DNA-sekvenser. Mens der er sket adskillige fremskridt i de sidste 10 år, de fleste nuværende high-throughput sekventeringsinstrumenter afhænger af optiske teknikker til påvisning af de fire byggesten i DNA:A, C, G og T. For yderligere at fremme målekapaciteten, elektronisk DNA-sekventering af et ensemble af DNA-skabeloner er også blevet udviklet.

For nylig, det har vist sig, at DNA kan føres gennem protein-porer på nanoskala under en påført elektrisk strøm for at producere elektroniske signaler på enkelt molekyle niveau. Imidlertid, fordi de fire nukleotider er meget ens i deres kemiske strukturer, de kan ikke let skelnes ved hjælp af denne teknik. Dermed, forskning og udvikling af en enkelt-molekyle elektronisk DNA-sekventeringsplatform er det mest aktive efterforskningsområde og har potentiale til at producere en håndholdt DNA-sequencer, der er i stand til at dechifrere genomet til personlig medicin og grundlæggende biomedicinsk forskning.

Et team af forskere ved Columbia University, ledet af Dr. Jingyue Ju (Samuel Ruben-Peter G. Viele professor i ingeniørvidenskab, professor i kemiteknik og farmakologi, direktør for Center for Genomteknologi og Biomolekylær Engineering), med kolleger ved National Institute of Standards and Technology (NIST) ledet af Dr. John Kasianowicz (Fellow of the American Physical Society), har udviklet en ny tilgang til potentielt at sekventere DNA i nanoporer elektronisk på enkelt molekyle niveau med enkelt-base opløsning. Dette arbejde, med titlen "PEG-mærkede nukleotider og nanoporedetektion til enkeltmolekyle DNA-sekventering ved syntese" er nu tilgængelig i online-tidsskriftet med åben adgang, Videnskabelige rapporter , fra Naturpublikationsgruppen.

Den rapporterede nanopore-baserede sekventering ved syntese (Nano-SBS) strategi kan præcist skelne fire DNA-baser ved at detektere 4 tags af forskellig størrelse frigivet fra 5'-phosphat-modificerede nukleotider på enkeltmolekyleniveau til sekvensbestemmelse. Det grundlæggende princip i Nano-SBS-strategien er beskrevet som følger. Da hver nukleotidanalog er inkorporeret i den voksende DNA-streng under polymerasereaktionen, dets mærke frigives ved dannelse af fosfodiesterbindinger. Mærkerne vil indtaste en nanopore i rækkefølgen af ​​deres udgivelse, producerer unikke ionstrømblokadesignaturer på grund af deres forskellige kemiske strukturer, hvorved DNA-sekvensen bestemmes elektronisk på enkelt molekyle niveau med enkelt base opløsning. Som bevis på princippet, forskerholdet vedhæftede fire forskellige længder polymer-tags til det terminale fosfat af 2'-deoxyguanosin-5'-tetraphosphat (en modificeret DNA-byggeblok) og demonstrerede effektiv inkorporering af nukleotidanalogerne under polymerasereaktionen, samt bedre end baseline diskrimination blandt de fire tags på enkelt molekyle niveau baseret på deres nanopore ioniske strøm blokade signaturer. Denne tilgang kombineret med polymerase knyttet til nanoporerne i et array-format skulle give en enkelt-molekyle elektronisk Nano-SBS-platform.

I tidligere arbejde, Center for Genome Technology &Biomolecular Engineering ved Columbia University, ledet af professor Ju og Dr. Nicholas J. Turro (William P. Schweitzer professor i kemi), udviklet en firfarvet DNA-sekventering ved syntese (SBS) platform ved brug af spaltelige fluorescerende nukleotid-reversible terminatorer (NRT), som er licenseret til Intelligent Bio-Systems, Inc., en QIAGEN-virksomhed. SBS med spaltelige fluorescerende NRT'er er den dominerende tilgang, der anvendes i næste generation af DNA-sekventeringssystemer. Dr. Kasianowicz og hans gruppe ved NIST var pionerer i undersøgelsen af ​​nanoporer til enkeltmolekyleanalyse. De har tidligere rapporteret, at polymerer med forskellig længde, polyethylenglycoler (PEG'er), kunne skelnes ved deres unikke virkninger på aktuelle aflæsninger i et α-hæmolysin protein nanoporer på enkelt molekyle niveau og efterfølgende udviklet en teori for metoden. Deres resultater giver proof-of-concept for enkelt molekyle massespektrometri. Kombinationen af ​​SBS-konceptet med de distinkte nanopore-detekterbare elektroniske tags til at mærke DNA-byggesten førte til udviklingen af ​​den enkeltmolekyle elektroniske Nano-SBS-tilgang, der beskrev den nuværende Videnskabelige rapporter artikel.

Som hovedforfatter Dr. Shiv Kumar påpeger, "Det nye ved vores tilgang ligger i designet og brugen af ​​fire forskelligt mærkede nukleotider, som ved inkorporering af DNA-polymerase, frigiver fire forskellige størrelsesmærker, der adskiller sig fra hinanden på enkelt molekyleniveau, når de passerer gennem nanoporen. Denne tilgang overvinder alle begrænsninger pålagt af de små forskelle mellem de fire nukleotider, en udfordring, som de fleste nanopore-sekventeringsmetoder har stået over for i årtier." Desuden, teknikken er ret fleksibel; med PEG-tags som prototyper, andre kemiske tags kan vælges for at give optimal adskillelse i forskellige nanopore-systemer.

Med videreudvikling af denne Nano-SBS tilgang, såsom brugen af ​​store arrays af protein eller faste nanoporer, dette system har potentialet til præcist at sekventere et helt menneskeligt genom hurtigt og til lave omkostninger, derved gør det muligt at bruge det til rutinemæssige medicinske diagnoser.