To-foton mikroskopi:Ny forskning kan bidrage drastisk til at reducere omkostningerne ved kraftfuld mikroskopteknik

(Phys.org) — En farvestofbaseret billeddannelsesteknik kendt som to-fotonmikroskopi kan producere billeder af aktive neurale strukturer i meget finere detaljer end funktionel magnetisk resonansbilleddannelse, eller fMRI, men det kræver kraftige og dyre lasere. Nu, et forskerhold ved University of Pennsylvania har udviklet en ny slags farvestof, der kan reducere omkostningerne ved teknikken med flere størrelsesordener.

Undersøgelsen blev ledet af lektor Sergei Vinogradov og postdoc-forsker Tatiana Esipova, både fra Institut for Biokemi og Molekylær Biofysik i Penns Perelman School of Medicine, sammen med Christopher Murray, en professor i afdelingerne for kemi på School of Arts and Sciences og for Materials Science and Engineering på School of Engineering and Applied Science.

Den blev offentliggjort i Proceedings of the National Academy of Sciences .

To-fotonmikroskopi involverer brug af en kraftig laser til hurtigt at skyde fotoner i en stærkt fokuseret stråle, der kan passere gennem levende væv. Den kombinerede energi af et par infrarøde fotoner, der kolliderer med et molekyle af et markørfarvestof, får det til at fluorescere i det synlige område. Ved at scanne strålens fokus over et tredimensionelt rum, fluorescensen af ​​farvestoffet kan afsløre selv de mindste 3D-strukturer, såsom blodkapillærer i hjernen og endda individuelle celler. Og ved at bruge farvestoffer, der er følsomme over for kemien i specifikke biologiske processer, såsom bevægelse af calciumioner, der tillader neuroner at affyre, teknikken kan endda bruges til funktionel billeddannelse; det kan fornemme ændringer i neural aktivitet, mens et subjekt tænker.

"Det er praktisk talt den eneste måde at se på individuelle celler eller endda subcellulære strukturer i hjernen i dybden, " sagde Vinogradov. "FMRI giver dig kun større regioner; du kan ikke se detaljerne. Og mange af de ting, vi er interesserede i at undersøge, er meget tæt på hinanden."

Ulempen ved denne teknik er, at aktuelt tilgængelige farvestoffer kræver enorme mængder energi for at producere brugbare billeder. Forskere skal bruge femtosekundlasere, som kan skyde en kvadrillion fotonpar i sekundet. Disse lasere er meget dyre, imidlertid, begrænse anvendelsen af ​​mikroskopiteknikken.

En mulig løsning ville være at bruge et farvestof, der fluorescerer lettere. Til denne ende, nanopartikler fremstillet af lanthanid-elementerne er længe blevet undersøgt som molekylære prober.

"Disse nanopartikler har en excitabilitet, der er en million til 10 millioner gange højere end eksisterende molekylære farvestoffer, " sagde Vinogradov. "Det betyder for at excitere disse nanopartikler, du kan bruge en lyskilde, der koster tættere på $200 i stedet for $200, 000."

Udfordringen var så at få lanthanid-nanopartikler ind i den slags væv, forskere ønskede at studere, såsom hjernen. Fordi disse nanopartikler ikke er opløselige, de kan ikke sikkert sprøjtes ind i blodbanen. I stedet for at flyde sammen med blodet, de ville sidde på bunden af ​​blodkar, til sidst danner en blodprop.

Andre grupper havde forsøgt at øge nanopartiklernes opløselighed ved at pakke dem ind i hydrofile, eller vandelskende, polymerer. Disse polymerer er i det væsentlige strenge med en hale, der tiltrækkes af vand og et hoved, der tiltrækkes af partiklen. I teorien, hovedet ville binde sig til nanaopartikeloverfladen, og halen ville interagere med blodbanen, men, fordi strengen ville blive knyttet til partiklen ved et enkelt kontaktpunkt, den kunne let falde af. Tilføjelse af flere partikelbindingssteder til strengen løser et problem, men skaber et andet.

"Denne slags snor vikler sig ind og klæber til partiklen, men ingen af ​​dets hydrofile dele forbliver tilgængelige til at interagere med opløsningsmidlet, " sagde Vinogradov. "Det hæfter sig til nanopartiklerne, men gør det ikke væsentligt mere opløseligt."

Vinogradov og hans kolleger tog en anden tilgang, fremstilling af dendritiske polymerer. Disse dendrimerer har flere grene knyttet til en kerne, giver dem en samlet sfærisk form.

"Forestil dig, at du har en tennisbold, og du klæber den til en velcrobelagt væg. Fordi det er en bold, der er stadig en betydelig del af dens overflade, der stadig er blotlagt, " Vinogradov sagde. "Vi tager lanthanid nanopartikler og dækker hele deres overflade med disse hydrofile kugler. Det er et meget simpelt geometrisk koncept."

At fæstne disse dendrimerer til nanopartikler var muligt på grund af Christopher Murrays tidligere forskning, hvilket muliggjorde en speciel procedure til at "prime-coat" nanopartikeloverflader med et lag, der letter deres interaktion med dendrimerer.

Forskerne testede effektiviteten af ​​denne tilgang på en musemodel. De startede med at injicere et konventionelt markørfarvestof og bruge en femtosekundlaser til at kortlægge vaskulaturen i en del af musens hjerne. De skiftede derefter til en laser, der var en million gange svagere og kortlagde den samme region igen, forudsigeligt producerer ingen fluorescens. Endelig, de beholdt den samme svage laser, men injicerede de dendrimer-coatede nanopartikler, hvilket gjorde det muligt for forskerne at producere de samme billeder som i det første forsøg.

"Det betyder, at vi lavede det samme eksperiment som femtosekundlaseren, men med en, der koster hundredtusindvis af dollars mindre, " sagde Vinogradov.

Dette eksperiment var den første demonstration af brugen af ​​lanthanid nanopartikler i neuromiaging såvel som det første eksempel på to-foton in vivo mikroskopi med simple, billige lasere.