Teknik til kvantificering af erytrocyt zink protoporphyrin IX og protoporphyrin IX

Ved hæmbiosyntese, det terminale trin er indsættelsen af ​​ferrojern i protoporphyrin IX (PPIX) af enzymet ferrochelatase. Under fysiologiske forhold, små mængder zinkprotoporphyrin IX (ZnPP) dannes også. Koncentrationerne af ZnPP og PPIX i erythroide celler er karakteristisk ændret af forhold, der påvirker tilgængeligheden af ​​jernholdigt jern, øge mængden af ​​PPIX, eller mindske den enzymatiske aktivitet af ferrochelatase. Desværre, den standard HPLC-baserede kvantificeringsmetode er tidskrævende og kompliceret. Alternativer, også, har vist sig at være for teknisk krævende eller besværlige til generel adoption. Til måling af ZnPP alene, et bærbart front-face fluorometer, hæmatofluorometeret, er kommercielt tilgængelig. Endnu, dets anvendelse er begrænset af en høj baggrundsfluorescens af andre blodbestanddele, hvilket gør prøvevask uundgåelig.

Et forskerhold ledet af Georg Hennig fra Klinikum der Universität München (Tyskland) har nu udviklet en ny metode til samtidig kvantificering af ZnPP og PPIX i uvaskede blodprøver. Den er baseret på excitation med to bølgelængder for effektivt at eliminere baggrundsfluorescens fra andre blodbestanddele. De opnåede resultater var tæt korreleret med bestemmelser ved hjælp af et reference-HPLC-assay.

Nøglen til succes var valget af passende excitationsbølgelængder. Begge skal gennemgå praktisk talt identisk absorption, og deres spektrale adskillelse skal være lille, så fotonernes indtrængningsdybder i det væsentlige er de samme. Excitationseffektiviteten af ​​de fluoroforer, der er ansvarlige for autofluorescens, bør kun afvige en lille smule mellem de to excitationsbølgelængder, således at subtraktion af emissionsspektrene effektivt eliminerer autofluorescens. I modsætning, analytfluoroforen bør udvise en stor forskel i excitationseffektivitet mellem disse to excitationsbølgelængder, således at forskellen mellem emissionsspektrene er stor og ikke eliminerer analytfluoroforsignalet.

Dette er tilfældet for 425 nm (ZnPP-fluorescensexcitationsmaksimum, emissionsmaksimum ved 593 nm) og 407 nm som en tilsvarende bølgelængde med identisk oxygeniseret hæm-absorption, men væsentligt lavere ZnPP excitationseffektivitet. I øvrigt, når excitationsbølgelængden ved 407 nm nærmer sig PPIX excitationsmaksimum ved 397 nm, emissionsspektret viser en udtalt PPIX-fluorescensemissionsspids, som findes ved 627 nm. Da PPIX excitationseffektiviteten er meget lavere ved 425 nm, PPIX-fluorescensemissionstoppen elimineres ikke i forskelsspektret og kan evalueres sammen med ZnPP-signalet.

Den nye tilgang kunne enkelt og omkostningseffektivt implementeres i en enhed til brug under markforhold. Ud over, det kan reducere autofluorescens i væv såsom mundslimhinden in vivo, muliggør ikke-invasive målinger af ZnPP og PPIX. (Tekst bidraget af K. Maedefessel-Herrmann)