Molekylær beacons skinner lys på, hvordan celler kravler

Klæbende celler, den slags, der danner arkitekturen for alle flercellede organismer, er mekanisk konstrueret med præcise kræfter, der gør det muligt for dem at bevæge sig rundt og holde sig til ting. Proteiner kaldet integrinreceptorer fungerer som små hænder og fødder til at trække disse celler hen over en overflade eller forankre dem på plads. Når grupper af disse celler sættes i en petriskål med en række forskellige substrater, kan de mærke forskellene i overfladerne, og de vil "kravle" mod den stiveste, de kan finde.

Nu har kemikere udtænkt en metode, der bruger DNA-baserede spændingsprober til at zoome ind på molekylært niveau og måle og kortlægge disse fænomener:Hvordan celler mekanisk føler deres omgivelser, migrere og holde sig til ting.

Naturkommunikation offentliggjort forskningen, ledet af laboratoriet af Khalid Salaita, assisterende professor i biomolekylær kemi ved Emory University. Medforfattere omfatter mekaniske og biologiske ingeniører fra Georgia Tech.

Ved at bruge deres nye metode, forskerne viste, hvordan de kræfter, der påføres af fibroblastceller, faktisk er fordelt på det individuelle molekyleniveau. "Vi fandt ud af, at hver af integrin-receptorerne på omkredsen af ​​celler dybest set 'føler' mekanikken i sit miljø, " siger Salaita. "Hvis overfladen de føler er blødere, de vil løsne sig fra det, og hvis det er mere stift, de vil binde. De kan lide at plante deres pæle i fast jord."

Hver celle har tusindvis af disse integrinreceptorer, der spænder over cellemembranen. Cellebiologer har længe været fokuseret på de kemiske aspekter af, hvordan integrinreceptorer fornemmer miljøet og interagerer med det, mens forståelsen af ​​de mekaniske aspekter haltede. Cellulær mekanik er et relativt nyt, men voksende område, som også involverer biofysikere, ingeniører, kemikere og andre specialister.

"Masser af gode og dårlige ting, der sker i kroppen, medieres af disse integrin-receptorer, alt fra sårheling til metastatisk kræft, så det er vigtigt at få et mere komplet billede af, hvordan disse mekanismer virker, " siger Salaita.

Salaita-laboratoriet har tidligere udviklet en fluorescerende sensorteknik til at visualisere og måle mekaniske kræfter på overfladen af ​​en celle ved hjælp af fleksible polymerer, der fungerer som små fjedre. Disse fjedre er kemisk modificerede i begge ender. Den ene ende får en fluorescens-baseret tænd-sensor, der vil binde til en integrin-receptor på celleoverfladen. Den anden ende er kemisk forankret til et objektglas og et molekyle, der slukker fluorescens. Når der påføres kraft på polymerfjederen, den strækker sig. Afstanden fra quencheren øges, og det fluorescerende signal tændes og bliver lysere. Måling af mængden af ​​udsendt fluorescerende lys bestemmer mængden af ​​kraft, der udøves.

Yun Zhang, en medforfatter til Naturkommunikation papir og en kandidatstuderende i Salaita-laboratoriet, havde ideen om at bruge DNA-molekylære beacons i stedet for fleksible polymerer. "Hun var ny i laboratoriet og bragte et nyt perspektiv, " siger Salaita.

De molekylære beacons er korte stykker af laboratoriesyntetiseret DNA, hver bestående af omkring 20 basepar, bruges i klinisk diagnostik og forskning. Beacons kaldes DNA-hårnåle på grund af deres form.

Termodynamikken af ​​DNA, dens dobbeltstrengede helixstruktur og den energi, der skal til for at den kan foldes, er godt forstået, gør DNA-hårnålene til mere raffinerede instrumenter til kraftmåling. En anden vigtig fordel er det faktum, at deres ender konsekvent er i samme afstand fra hinanden, Salaita siger, i modsætning til de tilfældige spoler af fleksible polymerer.

I eksperimenter, DNA-hårnålene viste sig at fungere mere som en vippekontakt end en lysdæmper. "De polymerbaserede spændingsprober afvikles gradvist og bliver lysere, efterhånden som der påføres mere kraft, " siger Salaita. "I modsætning hertil, DNA-hårnåle rykker ikke, før du anvender en vis mængde kraft. Og når først den kraft er påført, de begynder at pakke lynene ud og bliver bare ved med at optrevle."

Ud over, forskerne var i stand til at kalibrere kraftkonstanten for DNA-hårnålene, gør dem meget justerbare, digitale instrumenter til at beregne mængden af ​​kraft påført af et molekyle, ned til piconewton niveau.

"Tyngekraften på et æble er omkring en newton, så vi taler om en million-milliontedel af det, "Siger Salaita. "Det er lidt ufatteligt, at det er så lidt kraft, du behøver for at folde et stykke DNA ud."

Resultatet er en spændingssonde, der er tre gange mere følsom end polymerproberne.

I et separat papir, udgivet i Nano bogstaver , Salaita-laboratoriet brugte de DNA-baserede sonder til at eksperimentere med, hvordan tætheden af ​​et substrat påvirker den påførte kraft. "Intuitivt tror du måske, at et mindre tæt miljø, tilbyder færre forankringspunkter, ville resultere i mere kraft pr. anker, " sagde Salaita. "Vi fandt ud af, at det faktisk er det modsatte:Du vil se mindre kraft pr. anker."

Mekanismen for at registrere ligandafstand og vedhæftning til et substrat ser ud til at være kraftmedieret, han siger. "Integrin-receptorerne skal være tæt placeret, for at motoren i cellen, der genererer kraft, kan engagere sig med dem og begå kraften."

Nu bruger forskerne de DNA-baserede værktøjer, de har udviklet, til at studere kræfterne fra mere følsomme cellulære veje og receptorer.

"Integrin-receptorer er en slags dyr, de anvender relativt høje kræfter for at klæbe til den ekstracellulære matrix, " siger Salaita. "Der er masser af forskellige cellereceptorer, der anvender meget svagere kræfter."

T-celler, for eksempel, er hvide blodlegemer, hvis receptorer ikke er fokuseret på adhæsion, men på aktiviteter som at skelne et venligt selv-peptid fra et fremmed bakterielt peptid.

Salaita-laboratoriet samarbejder med medicinske forskere på tværs af Emory for at forstå cellemekanikkens rolle i immunsystemet, blodkoagulering og neurale mønstre af axoner.

"I bund og grund, vores præmis er, at mekanik spiller en rolle i næsten alle biologiske processer, og med disse DNA-baserede spændingsprober skal vi afsløre, måle og kortlægge disse kræfter, " siger Salaita.