Team avancerer elektronisk DNA -sekventering med enkelt molekyle

Forskere fra Columbia University, med kolleger hos Genia Technologies (Roche), Harvard University og National Institute of Standards and Technology (NIST) rapporterer at opnå real-time enkeltmolekyle elektronisk DNA-sekventering ved enkeltbaseret opløsning ved hjælp af et protein-nanopore-array.

DNA -sekventering er nøgleteknologien til personlige og præcisionsmedicinske initiativer, muliggør hurtige opdagelser inden for biomedicinsk videnskab. En persons komplette genom -sekvens giver vigtige markører og retningslinjer for medicinsk diagnostik, sundhedspleje, og opretholde et sundt liv. Til dato, omkostningerne og hastigheden ved at opnå meget præcise DNA -sekvenser har været en stor udfordring. Selvom der er sket forskellige fremskridt i løbet af det sidste årti, high-throughput sekventeringsinstrumenterne, der er meget udbredt i dag, afhænger af optik til påvisning af fire DNA-byggesten:A, C, G og T. For at undersøge alternative målefunktioner, elektronisk sekventering af et ensemble af DNA -skabeloner er blevet udviklet til genetisk analyse. Nanopore streng sekvensering, hvor et enkeltstrenget DNA trækkes gennem nanoskala -porerne under en påført elektrisk spænding for at producere elektroniske signaler til sekvensbestemmelse på enkeltmolekylniveau, er for nylig blevet udviklet imidlertid, fordi de fire nukleotider er meget ens i deres kemiske strukturer, de kan ikke let skelnes ved hjælp af denne metode. Forskere forfølger derfor aktivt forskning og udvikling af en præcis enkeltmolekyle elektronisk DNA-sekventeringsplatform, da den har potentiale til at producere en miniaturiseret DNA-sequencer, der er i stand til at dechiffrere genomet for at lette personlig tilpasset præcisionsmedicin.

Et team af forskere ved Columbia Engineering, ledet af Jingyue Ju (Samuel Ruben-Peter G. Viele professor i teknik, Professor i kemiteknik og farmakologi, Direktør for Center for genomteknologi og biomolekylær teknik), med kolleger på Harvard Medical School, ledet af George Church (professor i genetik); Genia Technologies, ledet af Stefan Roever (CEO for Genia); og John Kasianowicz, hovedundersøgeren hos NIST, har udviklet et komplet system til sekvensering af DNA i nanoporer elektronisk på enkeltmolekylniveau med enkeltbaseret opløsning. Dette arbejde, berettiget, "Real-time enkeltmolekyle elektronisk DNA-sekventering ved syntese ved hjælp af polymermærkede nukleotider på et Nanopore-array, "er offentliggjort i tidsskriftet, Procedurer fra National Academy of Sciences ( PNAS ) Tidlig udgave.

Tidligere har forskere fra laboratorierne i Ju i Columbia og Kasianowicz ved NIST rapporterede det generelle princip om nanoporesekvensering ved syntese (SBS), gennemførligheden af ​​design og syntese af polymermærkede nukleotider som substrater for DNA-polymerase påvisning og differentiering af polymermærkerne med nanopore på enkeltmolekylniveau [ Videnskabelige rapporter 2, 684 (2012) DOI:10.1038/srep00684]. Den nuværende PNAS papir beskriver konstruktionen af ​​det komplette nanopore SBS-system til fremstilling af enkeltmolekyle elektroniske sekventeringsdata med enkeltbaseret opløsning. Denne SBS-strategi adskiller nøjagtigt fire DNA-baser ved elektronisk at detektere og differentiere fire forskellige polymermærker, der er knyttet til 5'-phosphatet af nukleotiderne under deres inkorporering i en voksende DNA-streng katalyseret af polymerase, et DNA-syntetiserende enzym. Forskerne designede og syntetiserede nye nukleotider mærket ved terminalphosphatet med oligonukleotidbaserede polymerer til at udføre nanopore SBS på en α-hemolysin protein nanopore array platform. Mærkerne på de polymermærkede nukleotider, som blev verificeret til at være aktive substrater for DNA -polymerase, producere forskellige elektriske strømblokade niveauer. De konstruerede et nanopore -array på en elektronisk chip med flere elektroder; arrayet består af proteinkanaler, der var koblet til en DNA -polymerase, der var bundet til en primet DNA -skabelon. Tilføjelse af særskilte specialdesignede polymermærkede nukleotider til nanopore-arrayet udløser DNA-syntese. Ved at blokere kanalens ionstrøm til forskellige niveauer, de forskellige tags giver en aflæsning af skabelonsekvensen i realtid med enkeltbaseret opløsning.

Som Carl Fuller, hovedforfatter, Adjungeret seniorforsker i Ju -laboratoriet i Chemical Engineering Department i Columbia og Director of Chemistry hos Genia, påpeger, "Nyheden i vores nanopore SBS -tilgang begynder med designet, syntese, og udvælgelse af fire forskellige polymermærkede nukleotider. Vi bruger en DNA -polymerase kovalent knyttet til nanoporen og de mærkede nukleotider til at udføre SBS. Under replikation af det DNA, der er bundet til polymerasen, mærket for hvert komplementær nukleotid fanges i poren for at producere et unikt elektrisk signal. Fire forskellige polymermærker, der giver tydelige signaturer, der genkendes af den elektroniske detektor i nanopore -arraychippen, bruges til sekvensbestemmelse. Dermed, DNA -sekvenser opnås for mange enkeltmolekyler parallelt og i realtid. De fire polymermærker er designet til at tilbyde meget bedre sondringer indbyrdes, i modsætning til de små forskelle mellem de fire native DNA -nukleotider, derved overvinde den store udfordring, som andre direkte nanopore sekventeringsmetoder står over for. "Desuden mærkerne kan optimeres yderligere med hensyn til størrelse, oplade, og struktur for at give optimal opløsning i nanopore SBS -systemet.

"Dette spændende projekt samler forskere og ingeniører fra både akademi og industri med kombineret ekspertise inden for molekylær teknik, nanoteknologi, genomik, elektronik og datavidenskab til at producere revolutionerende, omkostningseffektive genetiske diagnostiske platforme med et hidtil uset potentiale for præcisionsmedicin, "siger Ju." Vi er yderst taknemmelige for den generøse støtte fra NIH, der gjorde det muligt for os at gøre hurtige fremskridt inden for forskning og udvikling af nanopore SBS -teknologien, og de fremragende bidrag fra alle medlemmer af vores forskningskonsortium. "

Ifølge Ju, forskerne har allerede skubbet ud over, hvad der blev demonstreret i PNAS undersøgelse, hvor sekventeringsdata blev opnået på en tidlig prototype -sequencer baseret på nanopore SBS. Gennemstrømningen og ydeevnen for den nuværende sequencer er gået ud over, hvad der blev rapporteret i PNAS papir. Muligheden for at nå læselængder på over 1000 baser af DNA er for nylig blevet opnået. Fremadrettet, det kollaborative forskerteam vil fortsætte med at optimere tagsne ved at tilpasse linkerne, struktur, og ladning på molekylært niveau, og finjustering af polymerasen og elektronikken til nanopore SBS -systemet med det formål at præcist sekvensere et helt menneskeligt genom hurtigt og til lave omkostninger, hvilket gør det muligt at bruge det i rutinemæssige medicinske diagnoser.