Opbygning af bedre nanodiske:Forbedret værktøj giver et hidtil uset syn på virusinfektion

Harvard Medical School -forskere har forbedret designet af små nanodiscs - syntetiske modeller af cellemembraner, der bruges til at studere proteiner, der styrer, hvad der kommer ind i og forlader en celle. Forbedringerne giver et hidtil uset billede af, hvordan vira inficerer celler.

De nye nanodiske er mere stabile end tidligere versioner og, for første gang, kan laves i flere præcise størrelser og former.

"Vi har endelig et defineret miljø, hvor vi kan studere, hvordan vira eller andre proteiner interagerer med membranproteiner og få detaljer som aldrig set før, sagde Gerhard Wagner, Elkan Blout-professor i biologisk kemi og molekylær farmakologi ved HMS og seniorforfatter til undersøgelsen.

Designforbedringerne betyder, at videnskabsmænd nu kan se under et mikroskop som vira - i dette tilfælde, poliovirus – dock med nanoskiverne, åbne en pore og injicere deres genetiske materiale.

"Et af de store mål inden for virologi er at trin for trin forstå, hvordan vira kommer ind i celler og lave en 'molekylær film, sagde første forfatter Mahmoud Nasr, en forsker i Wagner-laboratoriet. "Håbet er, at disse nanodiske vil hjælpe os med at samle flere detaljer om denne proces, så vi kan designe vacciner og småmolekylære lægemidler til at forhindre virusindtrængning."

Ud over, Indlejring af forskellige proteiner i nanodiskene og tumbling af dem i kernemagnetisk resonans (NMR) spektrometre giver skarpere billeder af proteinernes strukturer og dynamik, end det tidligere var muligt, hjælper forskere med bedre at forstå proteinernes funktioner i kroppen.

Resultaterne blev rapporteret i Naturmetoder den 21. november.

Spænder bæltet

Såkaldte fosfolipid-to-lags nanodiscs er dybest set bundter af fedt, der blev cinched omkring taljen af ​​et par proteinbælter. Fedtstofferne, eller lipider, danne et dobbelt lag som det i den naturlige cellemembran. Forskere kan derefter indlejre membranproteiner i dobbeltlaget.

Nanodiscs dukkede op i begyndelsen af ​​2000'erne som et alternativ til andre membransurrogater, der er overdimensionerede eller ustabile, eller som kræver rengøringsmidler, som forstyrrer den naturlige proteindynamik. Men nanodiske præsenterede deres egne problemer. For eksempel, forskere kunne ikke lave dem i ensartede størrelser, smider testresultater.

Wagners team erkendte, at problemet sandsynligvis lå i det faktum, at proteinbælterne omkring nanodskivene åbnede sig, så skiverne ballonerede med ujævne mængder lipid.

Helt sikkert, da forskerne lavede noget fancy kemi for at spænde bælterne, nanodiskene kom ud i et meget smallere størrelsesområde. Skiverne holdt også bedre sammen over tid og ved de høje temperaturer, der var nødvendige for NMR-forsøg.

Forskerne fandt ud af, at de kunne forkorte eller forlænge bælterne og stadig lukke dem, tillader nanodiskene at blive tilpasset til at passe til specifikke membranproteiner. Indtil nu, de har lavet diske med en diameter på 9, 11, 15 og 50 nanometer.

At være i stand til at kontrollere størrelsen af ​​nanodiske udvider værktøjernes anvendelighed til en række proteiner og teknologier. NMR kræver små skiver og proteiner, for eksempel, mens elektronmikroskopi ofte har brug for store.

"Du kan ikke bruge små nanodiske til at studere enorme proteinkomplekser eller til at se på vira, som har brug for et minimumsareal for at danne en pore, " sagde Nasr.

De fleste af nanoskiverne er cirkulære, selvom forskerne også roder med en række polygonale former, fra trekanter til sekskanter.

"Vi håber, at ved at pakke sammen mere effektivt end cirkulære nanodiske, de polygonale nanodiscs, især hvis vi kan lave mindre, vil hjælpe os med at dyrke gode krystaller, som giver os en anden måde at løse strukturerne af de membranproteiner, vi indlejrer i dem, " sagde Nasr.

Viral søger

Nede ad gangen fra Wagners laboratorium, James Hogle, Edward S. Harkness professor i biologisk kemi og molekylær farmakologi ved HMS, og hans postdoc-stipendiat Mike Strauss løb ind i vejspærringer i et forsøg på at lære, hvordan simple vira, såsom poliovirus, komme ind i cellerne.

"Der skal gå noget over membranen, " sagde Hogle. Der var nogle beviser for, at poliovirus åbnede porer i membranen og sendte kun deres genetiske materiale igennem, men de modelsystemer, forskerne brugte, kaldet liposomer, var for uregelmæssige og ustabile til at vise, hvad der skete i membranen.

"Vi kunne ikke se de ting, vi var interesserede i, sagde Hogle.

Ivrig efter at finde ud af, om de modificerede nanodiscs gav et bedre overblik, Hogle og Strauss slog sig sammen med Wagner og Nasr.

Først, Nasr byggede 50 nanometer skiver, der var store nok til at rumme alle puslespilsbrikkerne. Derefter indlejrede holdet proteiner i nanodiskene, der binder til poliovirus, tilføjet polioviruspartikler til blandingen, frøs prøverne ned og tog snapshots gennem et kryo-elektronmikroskop.

"Vi spurgte virussen, 'Kom vedhæft nanodisken, gå ind i cellen og vis os, hvad du laver, '" forklarede Nasr.

Billederne viste nogle viruspartikler, der tog agnen - vedhæftede sig til receptorproteinerne, åbne hvad der lignede porer gennem lipid-dobbeltlaget og frigive deres RNA, som om de forsøgte at inficere en rigtig celle.

"Ingen havde set sådan en pore før, " sagde Nasr.

Forskerne har endnu ikke bekræftet, at de genstande, de ser, virkelig er porer, men, Hogle sagde, "Vi ved, at de er der, fordi RNA'et går på tværs."

"De ligner bestemt porer, " tilføjede han. "Som de siger, 'Hvis den går som en and, og kvækker som en and...'"

Nasr forsøger nu at lave endnu bedre skræddersyede 30-nanometer-skiver for at hjælpe Hogles team med at bestemme strukturen af ​​poliovirus/receptorproteinkomplekset og grave videre i, hvad der sker i membranen.

"Nanodiskene er en spændende teknik, "sagde Hogle." Jeg kan ikke forestille mig nogen anden måde at se, hvordan poren ser ud. Mahmoud var meget klog til at få disse til at fungere og skabe et system, der åbner døren for en bred vifte af undersøgelser."

Forskerne håber, at deres første resultater tilskynder andre til at bruge nanodiskene til at undersøge mange virus/receptor-interaktioner. Allerede oversvømmet med anmodninger om samarbejde, Wagners gruppe har stillet en samling af proteinbælter til rådighed og udgiver en detaljeret protokol, så andre laboratorier kan bygge nanodiskene på egen hånd.

Struktur detaljer

Udover at studere viral indgang, Wagners team demonstrerede, at nanodiskene kan forbedre NMR -resultater og tillade flere membranproteiner at blive undersøgt ved hjælp af NMR. Disse inkluderer G-proteinkoblede receptorer, som omkring 40 procent af nutidens lægemidler er designet til at målrette mod.

"Med denne teknik, vi kan få fantastiske spektre, "sagde Wagner.

Fordi nanodiskene ikke nedbrydes ved høje temperaturer, "Vi kan lave NMR-eksperimenter i uger, og GPCR'erne nedbrydes ikke, " sagde Nasr.

Nanodiskene ser også ud til at stabilisere de proteiner, der er indlejret i dem.

"De er meget modstandsdygtige over for proteinskærende enzymer, der går ind og angriber dem, " sagde Wagner.