Tre dages billedbehandling fanger højopløsning, filmisk visning af fluehjerne (Opdatering)

En ny gennemstrømning af fluehjernen giver enhver mulighed for at suse forbi neuroner og besøge enhver af de 40 millioner synapser, hvor neuroner rører neuroner. Det er et superopløsningsbillede af de komplekse netværksforbindelser i insektets hjerne, der ligger til grund for adfærd lige fra fodring til parring.

Hvad der er hidtil uset, imidlertid, er, at dette 3-D kort over hele fluehjernen, som viser detaljer så små som 60 nanometer på tværs, blev fanget på mindre end tre dage.

Selvom detaljeniveauet ikke er helt så godt som det, der opnås med et elektronmikroskop, bestræbelser på fuldt ud at kortlægge fluehjernens neuroner og synapser med EM har taget 10 år og dusinvis af menneskers indsats. Det nye kort blev opnået tusind gange hurtigere ved at kombinere to state-of-the-art teknikker, ekspansionsmikroskopi og gitterlysplademikroskopi.

Et kort i finskala over hjernens komplette neurale netværk - den menneskelige hjerne, men også musens og fluens - har været en drøm for neuroforskere i årtier. Med det, de kunne spore forbindelserne mellem neuroner for at forstå, hvordan hjernen træffer beslutninger. Og ved at tælle synapser, neurovidenskabsmænd kunne bedømme styrken af ​​neurale forbindelser, såsom dem, der er ansvarlige for hukommelsen.

Den nye og hurtigere billeddannelsesteknik for hele hjernen vil hjælpe videnskabsmænd med at pirre de fluens neurale kredsløb, der i sidste ende også ligger til grund for den menneskelige hjernes funktion. Og det fungerer lige så godt til at kortlægge neurale kredsløb i små bidder af musehjernen, og potentielt den menneskelige hjerne.

"Du kan bruge år og år på at få et EM-billede af en fluehjerne, sagde nobelpristageren Eric Betzig, som opfandt gitterlys-arkmikroskopet, mens han var på Janelia Research Campus på Howard Hughes Medical Institute og nu er professor i molekylær- og cellebiologi og i fysik ved University of California, Berkeley. "Jeg kan se, at vi kommer til det punkt, hvor vi afbilder mindst 10 fluehjerner om dagen."

En sådan hastighed og opløsning vil lade videnskabsmænd stille nye spørgsmål, han sagde, hvordan hjerner er forskellige mellem mænd og kvinder, eller hvordan hjernekredsløb varierer mellem fluer af samme type.

"Vi har overskredet en tærskel for billedbehandling, sagde Edward Boyden fra Massachusetts Institute of Technology, der opfandt ekspansionsmikroskopi for fem år siden. "Det er derfor, vi er så begejstrede. Vi scanner ikke bare gradvist mere hjernevæv, vi scanner hele hjerner."

Betzig, Boyden og deres hold vil offentliggøre deres resultater i denne uge i tidsskriftet Videnskab .

Kombinerer ekspansion og lysarkmikroskopi

Den nye hjernescanningsteknik kom i stand, efter at Boyden bad Betzig om hjælp til at kombinere ekspansionsmikroskopi med Betzigs seneste højhastighedsbilleddannelsesteknik, gitterlysarkmikroskopi. Ekspansionsmikroskopi (ExM) involverer fiksering af væv og derefter udvide det som en ballon, mens de relative positioner af indre strukturer holdes uændrede. Den bruger en polyakrylamidgel som den i bleer, som svulmer, når den flyttes fra salt til rent vand. Lattice light-sheet microscopy (LLSM) bruger stærkt fokuserede lysstråler til hurtigt at samle et 3-D billede af en prøve en tynd skive ad gangen.

"Da de kom til mig første gang i 2016, Jeg var stadig skeptiker; Jeg var bekymret, først, om du kunne udvide sådan noget og ikke have det skævt som en sindssyg, " sagde Betzig. "Og så var jeg bange for, at mens prøverne er gennemsigtige, de ville stadig fordreje lyset som en pose kugler."

Arbejder på Janelia campus, de kombinerede hold, ledet af postdocs Ruixuan Gao og Shoh Asano fra Boydens MIT laboratorium og Srigokul Upadhyayula fra Harvard Medical School, fandt ud af, at efter at have udvidet hjernevævet med en faktor på fire, til en volumen 64 gange normal, det var næsten lige så klart som vand og uforvredet.

"Jeg var chokeret over, hvor perfekt lysningen var til at gøre den utrolig optisk ensartet, " han sagde.

Som resultat, gitterlys-arkmikroskopet var i stand til at producere et meget detaljeret og præcist billede af hjernen på niveau med enkelte synapser:en opløsning på omkring 60 nanometer, hvilket kun er en tiendedel af opløsningen af ​​EM. Flerfarvebilledet tog kun 62,5 timer.

Holdene testede ExLLSM-teknikken ikke kun på hele frugtfluehjernen, men også på en flig af musehjerne, der spænder over den millimetertykke cortex, med lignende resultater. De var i stand til at tælle alle synapserne i fluehjernen, i alt omkring 40 mio. Den menneskelige hjerne, med 80 milliarder neuroner og måske 7, 000 synapser pr. neuron, ville være meget mere udfordrende.

Betzig forudser, imidlertid, at med forbedringer i ekspansionsmikroskopi - nogle forskere har strakt væv 25 gange i hver retning - kunne de kombinerede teknikker opnå resultater næsten lige så gode som EM med hensyn til at kortlægge alle de neurale forbindelser i hjernen, et felt kendt som connectomics.

"Hvis du kunne få det til at virke ved 10 gange eller måske 15 gange udvidelse, du kunne sikkert sætte meget af EM ud af drift, " sagde han. "Det kan være godt nok at lave den tætte neurale sporing EM kan gøre, men meget meget hurtigere og billigere. Jeg synes, de skal passe på deres ryg. Det er der ikke endnu, men efter min mening, potentialet er der."

Fluorescensmikroskopi

Begge mikroskopteknikker involverer mærkning af proteiner i vævet med fluorescerende markører. I ekspansionsmikroskopi, vævet infunderes derefter med gelen, og markørerne tværbindes til gelstrukturen. Så fordøjes alt proteinet væk, efterlader, hvad Betzig kalder et "fluorescerende fantom." Ændring af saltkoncentrationen i mediet får gelen til at svulme, trækker markørerne med sig. Det bliver mest vand, hvilket forklarer dens klarhed.

Boyden brugte oprindeligt konfokal lysmikroskopi til at afbilde det udvidede væv, men han håbede, at LLSM ville afbilde prøven hurtigere og med endnu bedre opløsning, samtidig med at det fuldstændige tab af fluorescenssignal, der opstår ved billeddannelse dybt inde i tykke prøver, overvindes med konventionelle metoder. LLSM scanner et lysark så smalt som 400 nanometer, plan for fly gennem prøven, billeddannelse af fluorescensen fra markørerne i hvert belyst plan

Hver komplet scanning, svarende til næsten 10 terabyte data, er derefter samlet af computer til et 3-D-billede, der kan navigeres som et videospil. Den tidskrævende samling blev overvåget af Janelia datalogerne Stefan Saalfeld og Igor Pisarev, og derefter analyseret og visualiseret af Upadhyayula, som snart vil åbne et avanceret billedbehandlingslaboratorium ved UC Berkeley.

Ved at fastgøre fluorescerende markører til en af ​​de 10, 000 proteiner i hjernen, det skulle være muligt at kortlægge de ydre membraner af neuroner og andre celler, synapserne, hvor en neuron forbindes med en anden, de indre rum af hjerneceller, og meget mere.

Der er begrænsninger, imidlertid. Som med enhver form for super-opløsnings fluorescensmikroskopi, Bettig sagde, det kan være svært at dekorere proteiner med nok fluorescerende pærer til at se dem tydeligt i høj opløsning. Og da ekspansionsmikroskopi kræver mange behandlingstrin, der er stadig potentiale for, at artefakter kan introduceres. På grund af dette, han sagde, "Vi har arbejdet meget hårdt for at validere, hvad vi har gjort, og andre ville være klogt til at gøre det samme."