Udvinding af funktionelle mitokondrier ved hjælp af mikrofluidiske enheder

Mitokondrier er dynamiske, bioenergetiske intracellulære organeller, ansvarlig for energiproduktion via ATP-produktion under respiration. De er involveret i centrale cellulære metaboliske opgaver, der regulerer vitale fysiologiske reaktioner fra celler, herunder cellesignalering, celledifferentiering og celledød. Defekte mitokondrier er forbundet med flere kritiske menneskelige genetiske sygdomme, herunder neurodegenerative lidelser, kræft og hjerte-kar-sygdomme.

Den detaljerede karakterisering af funktionelle mitokondrier forbliver relativt uudforsket på grund af mangel på effektive organelleekstraktionsmetoder. For eksempel, ekstraktionsprocessen skal opretholde tilstrækkelig funktionalitet af organellen ex vivo til at belyse deres cytosoliske funktioner i nærvær af cytoskelet og andre subcellulære organeller. Da mitokondrier vokser i et komplekst retikulært netværk i celler for at gennemgå strukturelle vekslen, deres intracellulære karakterisering er yderligere kompliceret. Som resultat, in vitro analyse af mitokondrier forbliver den almindelige metode, at separat udtrække og forstå mitokondriers iboende egenskaber, uden interferens fra andre subcellulære organeller.

I en nylig undersøgelse, nu udgivet i Mikrosystemer og nanoteknik , Habibur Rahman og kolleger ved Institut for Biomedicinsk Teknik undersøgte muligheden for at kontrollere hydrodynamisk stress for effektiv mitokondriel ekstraktion. For det, de brugte cross-junction mikrofluidisk geometri på mikroskala til selektivt at forstyrre den cellulære membran, mens de sikrede mitokondriemembranens integritet.

Fremskridt inden for mikrofluidik har vist fordelene ved on-chip laboratorieprocedurer med signifikant reduceret prøvestørrelse og øget eksperimentel reproducerbarhed. Hydrodynamisk stress produceret i mikrofluidchips kan bruges til at åbne cellulære eller nukleare membraner forbigående under intracellulær genlevering. Potentialet af sådanne teknikker er sjældent blevet undersøgt for at udvinde subcellulære organeller, da de begrænsede geometrier af mikrokanaler kan forårsage tilstopning af subcellulære komponenter i mikromaskinerne.

Forfatterne optimerede de eksperimentelle driftsbetingelser baseret på tidligere undersøgelser for effektivt at makulere cellemembraner, mens de bibeholdt intakte mitokondrier i modelpattedyrcellelinjer. Modelcellelinjerne af interesse var humane embryonale nyreceller (HEK293), musemuskelceller (C2C12) og neuroblastomceller (SH-SY5Y).

I arbejdsprincippet for den foreslåede mikroskala-celle-shredder, forskerne målte forskellen i elasticitetsmodul mellem mitokondriemembranen og cellemembranen for at forstyrre cellen, samtidig med at mitokondriemembranen bibeholdtes. Et øget stressniveau i systemet kan forstyrre cellemembraner med højere elasticitetsmoduler (som set med neuroblastomcellelinjen). Undersøgelsen sammenlignede proteinudbyttet og koncentrationen af ​​ekstraherede funktionelle mitokondrier ved hjælp af den foreslåede metode vs. kommercielt tilgængelige kits for en række cellekoncentrationer.

Resultaterne viste, at den foreslåede mikroskala-celle-shreddermetode var mere effektiv end de kommercielle kits ved at give cirka 40 procent mere funktionelle mitokondrier. Forskerne var i stand til at bevare den strukturelle integritet af de ekstraherede organeller selv ved lave cellekoncentrationer. Metoden kunne hurtigt behandle en begrænset mængde prøver (200 µl).

De detaljerede resultater var en første i undersøgelsen demonstration af intakt og funktionel mitokondrier ekstraktion ved hjælp af mikroskala hydrodynamisk stress. Muligheden for at behandle en lav koncentration og lille prøvestørrelse er gunstig til kliniske undersøgelser af mitokondriel sygdom. For at teste den spænding, der udøves af det designede krydskryds, de brugte først en COMSOL Multiphysics-simuleringsmodel. Derefter, Rahman et al. eksperimentelt bestemt den volumetriske strømningshastighed for tre modelcellelinjer. Under eksperimentel cellemembranafbrydelse, under middel forskydningsspænding (16,4 Pa, for en flowhastighed på 60 µL/min.), subcellulære organeller blev frigivet og detekteret med øgede mitokondrielle positive signaler.

Forskerne sammenlignede kapaciteten af ​​den miniaturiserede celle-shredder med kapaciteten af ​​to kommercielle sæt:Dounce-homogenisatoren (mekanisk metode til celleafbrydelse) og Qproteome-mitokondrierisoleringssættet (kemisk metode til celleafbrydelse) til at udvinde mitokondrier. For at bestemme antallet af funktionelle mitokondrier ekstraheret, forskerne brugte MitoTracker - et fluorescerende farvestof, der farver mitokondrier under flowcytometrisk analyse. Resultaterne viste, at mikroskala-celle-shredderen var i stand til at udvinde 40 procent flere funktionelle mitokondrier sammenlignet med de kommercielle kits til både HEK 293- og C2C12-celler.

Rahman et al. udførte citratsyntaseanalysen for at bestemme mitokondriel integritet gennem enzymatisk aktivitet af beskadigede mitokondrier. Som før, sammenlignet med de kommercielle sæt, mitokondriel integritet var højere for dem, der blev ekstraheret ved hjælp af mikroskala-shredderen i HEK293- og C2C12-celler.

Undersøgelsen viste vigtigheden af ​​membranstivhed ved at validere det foreslåede koncept til at forstyrre neuroblastomcellemembraner (SH-SY5Y). Da SH-SY5Y-cellemembranen havde et højere elasticitetsmodul end både HEK293- og C2C12-cellelinjer, forskerne var nødt til at optimere den volumetriske flowhastighed i mikroskala-shredderen for effektivt at forstyrre SH-SY5Y-cellemembraner. Igen, sammenlignet med de kommercielle sæt ekstraktioner, ved anvendelse af den foreslåede metode leverede en signifikant højere koncentration af protein og funktionelle mitokondrier til cellelinjen af ​​interesse.

På denne måde Rahman et al. undersøgte muligheden for at forstyrre cellemembranen for at bevare integriteten af ​​mitokondrielle membraner i forskellige pattedyrmodelcellelinjer. De bestemte den optimale forlængelsesspænding og strømningshastighed inde i en bioreaktor med mikrofluidisk tværsnit, baseret på Young's modul for modelcellelinjen af ​​interesse. Under kanaldesign, forskerne inkluderede en halssektion i den mikrofluidiske bioreaktor fremstillet ved hjælp af blød litografi.

Den foreslåede mikrofluidiske mikroskala-celle-shredder demonstrerede overlegen evne til at udvinde funktionelle mitokondrier og proteiner ved at kontrollere hydrodynamisk stress for første gang, sammenlignet med kommercielt tilgængelige celleorganelekstraktionssæt. Forsøgene var gennemførlige selv med små mængder af prøver (200 µl volumen, indeholdende 10 ⁴ celler/ml) til potentielle kliniske anvendelser. Rahman et al. var i stand til trofast at replikere protokollen på tværs af tre cellelinjer. Det eksperimentelle arbejde kan oversættes til et klinisk miljø for at forstå mitokondrielle dysfunktionsrelaterede lidelser i dybden.

© 2019 Science X Network